Los
cambios en las poblaciones microbianas en la piel de los animales
tradicionalmente han sido evaluados utilizando técnicas
convencionales de microbiología. La secuenciación de los genes
bacterianos 16S rRNA ha revelado que la piel humana está habitada
por un microbioma muy diversa y variable que no hubieran sido
previamente demostrada por los métodos de cultivo. Los objetivos de
este estudio fueron describir el microbioma habitan diferentes áreas
de la piel canina, y para comparar el microbioma de la piel de perros
sanos y alérgicos.
El ADN
extraído a partir de los hisopos superficiales de la piel de los
perros sanos (n = 12 ) y alérgicos ( n = 6 ) de diferentes regiones
de la piel con pelo y las superficies mucosas se utilizaron para 454
pirosecuenciaciónes del gen 16S ARNr . La principal coordinación
del análisis de agrupación reveló para las diferentes zonas de la
piel a través de todos los perros, con algunos sitios de la mucosa y
de las regiones perianales agrupamiento por separado de los lugares
de la piel con pelo. El análisis de rarefacción reveló una gran
variabilidad individual entre las muestras obtenidas de los perros
sanos y entre las diferentes zonas de la piel .
La mayor
riqueza de especies y la diversidad microbiana se observaron en las
muestras de piel con pelo en comparación con las superficies mucosas
o uniones mucocutáneas . En todas las regiones analizadas , la más
abundante filum y familiares identificados en las diferentes regiones
de superficies de la piel y las mucosas estaban con Proteobacteria y
Oxalobacteriaceae . La piel de los perros alérgicos tenía menor
riqueza de especies en comparación con los perros sanos . Los perros
alérgicos tenían proporciones más bajas de la Betaproteobacteria
Ralstonia spp . en comparación con los perros sanos .
El
estudio demuestra que la piel de los perros está habitada por muchas
más ricas y diversas comunidades microbianas de lo que se pensaba,
basado en los métodos de cultivo utilizado. Nuestros datos de
secuencia revelan una gran variabilidad individual entre las muestras
obtenidas de los distintos pacientes. Las diferencias en la riqueza
de especies también se observó entre los perros sanos y alérgicos,
los perros alérgicos tenían menor riqueza de especies en
comparación con los perros sanos.
El
cuerpo humano está colonizado por una amplia variedad de
microorganismos, incluyendo bacterias, hongos, y virus. Estos
microorganismos residentes viven en una relación simbiótica con su
anfitrión. Sin embargo, un desequilibrio de este microbioma puede
resultar en daños a su huésped. La mayoría de los microorganismos
que componen el microbioma de piel humana no han sido cultivadas o
aisladas hasta la fecha. Métodos moleculares basados recientes, lo
más comúnmente es el gen 16S ARNr, ahora han permitido caracterizar
estas comunidades microbianas altamente complejos en diferentes
sitios del cuerpo humano. En la medicina veterinaria, la mayor parte
del conocimiento sobre los pequeños microbioma animal están basados
en el 16S rRNA que está en las comunidades microbianas presentes en
el tracto gastrointestinal.
Los
cambios en las poblaciones microbianas de la piel de los animales que
tradicionalmente han sido evaluadas utilizando técnicas de
microbiología convencionales, tales como los métodos de cultivo y
bioquímicos. La secuenciación de los genes bacterianos 16S rRNA ha
puesto de manifiesto que la superficie de la piel de los seres
humanos está habitada por una microbiota muy diversa y variable que
no ha sido previamente demostrada por métodos basados en la cultura.
Estos estudios han descrito la composición microbiana en diferentes
regiones de la piel, con Propionibacterium spp. predominante en áreas
sebáceas, Staphylococcus y Corynebacterium spp. predominando en las
zonas húmedas y los organismos gram negativas (por ejemplo, la
Betaproteobacteria) colonizando las áreas de la piel seca, como el
antebrazo o la pata.
Por otra
parte, la edad ha demostrado influir en el microbioma de la piel,
como los niños que tienen una diferente flora de la piel que los
adultos. Es necesario realizar estudios similares en los perros y
otras especies animales para investigar mejor el papel del microbioma
de la piel en la salud y la enfermedad. Existen pocos reportes sobre
el microbioma de la piel en los perros. Estos estudios, sin embargo,
sólo se investigaron algunos sitios de la piel en un pequeño número
de perros, o que se centraron principalmente en las relaciones
humanas y del perro.
La
microbiota normal de la piel es necesaria para la función óptima de
la piel, la modulación de la respuesta inmune innata y la prevención
de la colonización con los microorganismos potencialmente patógenos.
En muchas enfermedades de la piel, no queda claro si algunas
enfermedades de la piel son causadas por alteraciones en el
microbioma cutánea o si estas alteraciones son consecuencia de la
propia enfermedad de la piel. En los seres humanos con dermatitis
atópica (DA) y la psoriasis, se han propuesto los cambios en la
microbiota cutáneas que se debe a diferentes mecanismos, tales como
una función de barrera epidérmica alterada, el receptor de tipo
toll de 2 mutaciones, los niveles reducidos de péptidos
antimicrobianos, y / o un aumento de la expresión de las proteínas
de la matriz extracelular.
Estos
mecanismos propuestos se cree que son responsables de un aumento de
la prevalencia del estafilococos spp. y la susceptibilidad a las
infecciones estafilocócicas en pacientes humanos con AD. También se
ha demostrado que en los seres humanos con AD, la infección con
estafilococos aureus que se correlaciona con la gravedad clínica de
la enfermedad. Además, los estudios de metagenómica han mostrado
que S. aureus domina lesiones de la piel en pacientes humanos con AD,
aunque no hay cambios en la abundancia relativa de S. aureus se
identifican en las muestras nasales.
Al igual
que los humanos, los perros desarrollan AD con hipersensibilidad a
los alérgenos ambientales como los ácaros del polvo doméstico y /
o alérgenos alimentarios. El AD se considera una de las enfermedades
más comunes de la piel crónicas en los perros, que afecta
aproximadamente al 10% de los perros. En la mayoría de los perros
con AD, las lesiones primarias de la piel se caracteriza por máculas
y placas eritematosas intensamente pruriginosas y los sitios más
comunes de lesiones son las patas anteriores y posteriores, las
axilas y el abdomen (región inguinal). Los perros con AD a menudo
sufren de infecciones bacterianas y / o fúngicas secundarias, más
comúnmente debida a Staphylococcus pseudintermedius; estas
infecciones resultan en una exacerbación de lesiones de la piel con
el desarrollo de pápulas, pústulas, costras, y la alopecia.
El
objetivo principal de este estudio fue evaluar y describir la
diversidad del microbioma que habitan en diferentes áreas de la piel
canina, incluyendo las superficies de las mucosas, uniones
mucocutáneas y sitios de la piel conn pelo. Un objetivo secundario
de este estudio fue comparar el microbioma de la piel de perros sanos
con la de los perros con EA. Al igual que en los estudios que se
describen en las personas, que demuestran que el microbioma de la
piel en los perros es muy variable en las diferentes zonas evaluadas
de la piel, y que la diversidad de la microbiota de la piel en los
perros atópicos se reduce en comparación con los perros sanos.
Este
estudio ha sido aprobado por la Texas A & M University
Universidad (TAMU) Institucional Cuidado de Animales y el empleo
Comisión. El consentimiento informado para inscribirse casos
clínicos en el estudio se obtuvo de cada cliente.
Doce
perros sanos se inscribieron en este estudio; su edad osciló entre
los 8 meses y los 13 años (una media de 7,5 años). Hubo 6 perros
machos (1 intacto y 5 castrados, 3 Labradores, 1 Boston Terrier, 1
Carlino y 1 Pastor Australiano) y 6 perras hembras (5 esterilizadas y
1 intacta; 3 Labradores, 1 mestiza, 1 y 1 Pitbull Terrier) . Nueve
perros se mantuvieron principalmente en el interior, dos perros se
mantuvieron tanto en interiores como al aire libre, y un perro se
mantuvo exclusivamente en el exterior. Todos los perros que
cohabitaban con otros animales (perros y / o gatos). Los animales
sanos del estudio no tenían hallazgos históricos o clínicos
sugestivos de enfermedad alérgica en la piel, ni fueron tratados con
antibióticos, antiinflamatorios o fármacos inmunosupresores durante
al menos 6 meses antes de la recogida de las muestras.
Los
Perros Alérgicos
Seis
perros que estaban de entre 2 a 14 años (una media de 6,5 años de
edad) con enfermedades alérgicas de la piel también se inscribieron
en este estudio. Todos eran de raza pura (1 Boston Terrier, 1
Caniche, 1 Pastor Alemán, 1 Pitbull, 1 pastor australiano y 1 Golden
Retriever ), 4 machos estaban castrados y 2 hembras estabann
esterilizadas. Cinco perros estaban diagnosticados con AD utilizando
métodos de diagnóstico y terapéuticos estándar, incluyendo el
cumplimiento de por lo menos cinco de los criterios de Favrot y la
exclusión de otras dermatosis pruriginosas. (por ejemplo, acariasis
sarcóptica, dermatitis alérgica por pulgas, y las reacciones
adversas a los alimentos cutáneas)
Un perro
fue diagnosticado con dermatitis atópica como, exhibió signos de AD
pero con una hipersensibilidad mediada por IgE a los alérgenos
ambientales que no se pudo demostrar por cualquier alergeno
intradérmica específico o pruebas serológicas. Los perros
alérgicos se mantuvieron principalmente en interiores, pero sí
recibieron la prevención mensual de adulticida par las pulgas. Todos
los perros que co-habitan con otros animales (perros y / o gatos).
Para ser incluidos, los perros no pueden mostrar signos clínicos
evidentes de infección bacteriana de la piel o dermatitis
Malassezia, ni haber recibido antibióticos sistémicos durante al
menos 30 días, o tomar un baño durante al menos 7 días antes de la
toma de muestras.
Tres
perros estaban recibiendo dosis antiinflamatorias de los
glucocorticoides (administración en días alternos) o el fármaco
inmunomodulador ciclosporina (modificada), y tres estaban siendo
tratados con inmunoterapia específica con alergenos (SAIC). Dos de
los perros alérgicos (perros 13 y 18) no habían recibido
glucocorticoides en los 6 meses previos a la recogida de muestras, la
ciclosporina (perro 13 recibió ciclosporina 4 años antes del
estudio), o SAIC. Aunque los perros no tenían lesiones de la piel,
más expuesto leve a moderada prurito en el momento del estudio.
La
recogida de muestras
Se
recogieron muestras de 12 lugares de la piel de 12 perros sanos, para
un total de 144 muestras. Los sitios de la piel incluyen la mucosa
nasal derecha, la nariz dorsal derecha, comisura labial derecha, la
conjuntiva derecha, zona periocular derecha, canal del oído derecho,
pabellón auricular cóncavo, zona lumbar dorsal, axila derecha, la
ingle derecha, dorsal derecha piel interdigital entre los dígitos 4
y 5 de la pata derecha delantera, dorsal y área perianal. Se
recogieron muestras de 4 puntos de la piel de 6 perros alérgicos
para un total de 24 muestras. Los espacios pertenecientes la axila
derecha, la ingle derecha, mucosa nasal derecha, y la derecha de la
piel interdigital dorsal entre los dígitos 4 y 5 de la pata
delantera derecha.
Para
cada sitio de la piel, se utilizaron dos aplicadores de torunda de
cultivo estéril (BD Biosciences, NJ). Cada aplicador hisopo se frota
sobre la piel 40 veces, mientras que gira cada hisopo por cuarto por
cada 10 golpes. Los dos hisopos fueron almacenados en el mismo tubo
debidamente etiquetado y refrigeradas a 4 ° C hasta su posterior
análisis.
La
extracción de ADN y la Pirosecuenciación
El ADN
genómico fue extraído de cada conjunto de torundas estériles
recogidos de cada sitio de la piel usando el kit de aislamiento de
ADN suelo Mobio de alimentación ( Mobio Laboratorios ) , según lo
recomendado por el fabricante . Bacterial FLX- titanio amplicón
pirosecuenciación etiqueta codificada ( bTEFAP ) con base en la
región V1- V3 (posición de E. coli 27-519 ) del gen 16S rRNA se
realizó en el Laboratorio de ADN MR, Shallowater , TX, EE.UU. , como
se describió anteriormente , con cebadores directos 28F :
GAGTTTGATCNTGGCTCAG y revertir 519R : GTNTTACNGCGGCKGCTG [ 23 ] .
Secuencia de datos en bruto se proyectaron , recortado, se filtra, se
denoised y quimera agotan con la configuración predeterminada
utilizando el software QIIME tubería versión 1.6 . Las unidades
taxonómicas operacionales se definen como secuencias bacterianas con
al menos 97 % de similitud utilizando QIIME . Las secuencias
obtenidas en este estudio han sido depositadas en el NCBI Short Lee
Archive número de acceso SRP028524 .
El
análisis de los datos
Un total
de 779.812 secuencias fueron amplificados de todas las muestras de
piel de los perros sanos y alérgicas . Una media de 4.754 secuencias
(mediana de 3450 secuencias) se obtuvieron por muestra de cada sitio
de la piel , con un mínimo de 195 secuencias y un máximo de 55.956
secuencias por sitio . Debido a la profundidad de secuenciación
desigual entre los diferentes sitios y muestras , y para normalizar
el recuento de secuencias a través de muestras , se realizó el
análisis de datos en un subconjunto seleccionado de forma aleatoria
de 1.000 secuencias por muestra. Ciento treinta muestras de los
perros sanos y 17 muestras de los perros alérgicos tenían más de
1.000 secuencias , y se consideraron para el análisis de datos .
Todas
las muestras con menos de 1.000 secuencias por muestra se eliminaron
del análisis adicional . La diversidad alfa [es decir , la
rarefacción , el número de diferentes especies ( riqueza de
especies) por muestra ] , y la diversidad beta (es decir, las
comunidades microbianas similitud ) se calcularon y se representan
mediante el software v1.6 QIIME medidas. En las muestras de los
perros sanos que tenían un mayor número de secuencias , la
rarefacción también se realizó en un subconjunto seleccionado
aleatoriamente de 3.000 secuencias , para evaluar la riqueza de
especies en mayor profundidad secuenciación ( número de veces que
un sitio genómico específico es secuenciado en una ejecución de
secuenciación ) , y se evaluaron un total de 89 muestras.
Se
utilizó la distancia UniFrac análisis métrica basada en la
filogenia investigar las diferencias en las comunidades microbianas
entre sitios de la piel , así como entre los grupos ( sanos contra
los alérgicos ) . Tanto el ponderado , que representa la abundancia
relativa de secuencias en diferentes entornos , y no ponderado , que
no tiene en cuenta la abundancia relativa , se realizaron análisis
de UniFrac .
El
análisis de las similitudes de función ( ANOSIM ) en el paquete de
software estadístico PRIMER 6 ( PRIMER- E Ltd. , Luton, Reino Unido
) se utilizó en la matriz de la distancia ponderada y no ponderada
UniFrac para determinar si hay grupos de muestras contenían
significativamente diferentes comunidades bacterianas. Debido a un
ajuste para comparaciones múltiples , los valores de p iguales o
superiores a 0.001 se consideraron para la significación . Los
valores de R de la ANOSIM prueba estadística proporcionan una
estimación de la magnitud del efecto y rango de 1 a -1. R Los
valores más cercanos a 0 indican que no existen diferencias entre
las distintas zonas de la piel , mientras que los valores cercanos a
1 indican que existen diferencias entre las zonas de la piel .
Las
diferencias en las proporciones de los taxones de bacterias (
porcentaje de secuencias totales) entre los diferentes sitios, y
entre perros sanos y alérgicos se probaron para la normalidad , y
puesto que los datos no se distribuyen normalmente , se realizó una
prueba de Kruskal -Wallis no paramétrico , utilizando el paquete
estadístico JMP10 (SAS, Marlow , Buckinghamshire ) . Resultantes
p-valores fueron corregidos para comparaciones múltiples utilizando
el Benjamini y Tasa de Falso Descubrimiento de Hochberg [ 27 ] . Un
ajustado, p < 0,05 fue considerado para la significación
estadística .
Los
Resultados
Microbioma
de la piel de perros sanos
Piel
composición microbiana de los perros sanos.
Las
similitudes en la composición de la comunidad microbiana entre las
muestras se evaluaron con las cifras de distancia UniFrac sin
ponderar y ponderado. El UniFrac métricas no ponderado fue
significativamente diferente utilizando el análisis de ANOSIM,
cuando las superficies de la mucosa y zonas mucocutáneas donde la
comparación con los sitios de la piel con pelo. Sin embargo, cuando
se considera la métrica UniFrac ponderada, que da énfasis a la
abundancia de unidades taxonómicas operacionales (especies
bacterianas), menor número de sitios se consideraron
significativamente diferentes.
Las
principales parcelas coordenadas del análisis se construyeron
utilizando la UniFrac no ponderado métrica para evaluar las
similitudes de las comunidades microbianas al considerar individuo
(signalment, prurito asociado con la enfermedad alérgica en la piel,
problemas en los oídos, y la presencia de pulgas) y ambiental
(tiempo pasado en el interior y el tipo de entorno inmediato)
características en los perros sanos. Una agrupación, sobre la base
de similitudes de árboles filogenéticos moleculares bacterianas, no
se observó entre perros sanos cuando la raza, la edad, el sexo, la
presencia de pulgas, los hábitos de vivienda, cubierta y ambientes
al aire libre se compararon entre las diferentes muestras. Una gran
grado de variabilidad se observó en todas las muestras de los
diferentes sitios de la piel de cada perro, y a partir de muestras
del mismo sitio a través de todos los perros. La agrupación sólo
se observó para las diferentes zonas de la piel a través de todos
los perros, con algunos sitios de la mucosa y de las regiones
perianales, agrupación independiente de los lugares de la piel con
pelo.
Por: Aline Rodrigues Hoffmann mail, Adam P. Patterson, Alison Diesel, Sara D. Lawhon, Hoai Jaclyn Ly, Christine Elkins Stephenson, Joanne Mansell, Jörg M. Steiner, Scot E. Dowd, Thierry Olivry, Jan S. Suchodolski.
Por: Aline Rodrigues Hoffmann mail, Adam P. Patterson, Alison Diesel, Sara D. Lawhon, Hoai Jaclyn Ly, Christine Elkins Stephenson, Joanne Mansell, Jörg M. Steiner, Scot E. Dowd, Thierry Olivry, Jan S. Suchodolski.
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Por: Erik Farina (Psicólogo
Canino, Especialista en Comportamiento Canino)
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