Un nuevo estudio del Cáncer de Hueso de los Perros.

 

Un nuevo estudio del Cáncer de Hueso de los Perros.

El paisaje genómico de las líneas celulares de osteosarcoma canino revela una complejidad estructural conservada y alteraciones de las vías.

Introducción.

Las líneas celulares establecidas se utilizan comúnmente en la investigación preclínica del cáncer para ayudar a diseccionar muchas facetas de la biología del tumor, incluyendo la sensibilidad a las nuevas terapias y el papel de las aberraciones moleculares y genéticas en la progresión de la enfermedad.

La última década ha sido testigo de un crecimiento y una utilización sin precedentes de los datos genómicos tumorales para guiar los enfoques terapéuticos, de diagnóstico y de pronóstico. Por lo tanto, la incorporación continua y precisa de datos in vitro en la investigación del cáncer requiere una comprensión completa del panorama genómico de estas herramientas.

Esto es especialmente relevante en la evaluación preclínica de terapias dirigidas, que dependen del conocimiento del espectro de alteraciones genéticas en las células cancerosas. Por ello, la secuenciación del genoma completo y del exoma de las líneas celulares (WGS y WES, respectivamente) se evalúa cada vez más al mismo tiempo que las muestras de tumores primarios.

Aunque se ha realizado una amplia documentación de las líneas celulares tumorales humanas y murinas, las líneas celulares tumorales caninas han sido objeto de un análisis genómico relativamente limitado. Dado que los perros con cáncer espontáneo se utilizan cada vez más para evaluar nuevas terapias en el entorno preclínico, es importante que las herramientas de acompañamiento utilizadas para los estudios in vitro se definan a fondo, en particular con respecto al paisaje genómico.

Por ejemplo, en los estudios preclínicos se emplean diversas líneas celulares de osteosarcoma (OS) canino; sin embargo, se han caracterizado principalmente utilizando métodos que definen un espectro relativamente estrecho de alteraciones moleculares y de vías.

Se ha evaluado un número limitado de líneas de osteosarcoma mediante RNA-seq y WES, demostrando firmas transcripcionales conservadas y mutaciones puntuales en TP53 con tumores secuenciados.

Nosotros y otros hemos caracterizado recientemente el osteosarcoma primario canino utilizando WGS, WES y secuenciación de ARN, demostrando una significativa complejidad estructural, incluyendo aberraciones en SETD2, DMD, DLG2 y MYC, entre otras.

Varias de ellas no se observaron en el examen previo de las líneas celulares de osteosarcoma canino, en gran parte debido a que una característica definitoria del OS canino es la presencia de grandes cambios estructurales que son más difíciles de detectar mediante WES. Por lo tanto, realizamos WGS en ocho líneas celulares de osteosarcoma canino para caracterizar el paisaje del genoma del tumor y evaluar las similitudes y diferencias entre estas líneas celulares y los tumores primarios de OS canino que se producen naturalmente.

Materiales y métodos.

Adquisición de líneas celulares y extracción de ADN

Las líneas celulares OSCA2 y OSCA8 (por ejemplo, OSA2 y OSA8) fueron un generoso regalo del Dr. Jamie Modiano (Universidad de Minnesota). Las líneas celulares Abrams y Gracie fueron proporcionadas por el Dr. Douglas Thamm (Universidad Estatal de Colorado).

El ADN genómico extraído de las líneas celulares HMPOS, McKinley (por ejemplo, MacKinley), Moresco (por ejemplo, Marisco) y OS2.4 fue proporcionado por el Dr. Douglas Thamm (Universidad Estatal de Colorado). Las cuatro líneas celulares restantes (OSCA2, OSCA8, Abrams, Gracie) fueron confirmadas como negativas al micoplasma mediante PCR antes del aislamiento del ADN.

El ADN se aisló utilizando el DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen Inc., Hilden, Alemania). Se llevó a cabo una validación adicional de la línea celular mediante el perfil de repeticiones cortas en tándem (STR) en el ADNg extraído utilizado para la WGS con loci disponibles comercialmente (kit de genotipado canino Stockmarks, Applied Biosystems) según las recomendaciones del fabricante y se comparó con los loci disponibles publicados para cada línea celular cuando estaban disponibles.

Construcción de bibliotecas y secuenciación.

La WGS fue realizada por la Plataforma Genómica del Instituto Broad en una plataforma Illumina con seguimiento de la muestra con LIMS automatizado como se describió previamente. Brevemente, 100 ng de ADN genómico fueron sometidos a un cizallamiento utilizando un sonicador ultrafocalizado Covaris, seguido de una limpieza con perlas SPRI.

Se utilizó el KAPA Hyper Prep Kit con Library Amplification Primer Mix (KAPA Biosystems; #KK8504) con adaptadores palindrómicos en horquilla que contenían una secuencia de índice única de 8 bases (Roche). Tras la normalización de las bibliotecas a 2,2 nM, se completó la amplificación de grupos y la secuenciación en un HiSeqX, utilizando los kits de secuenciación por síntesis para generar lecturas de 151 pb de extremo emparejado. Las muestras se secuenciaron a una profundidad objetivo de 30x.

Preprocesamiento de los datos de secuenciación.

Las muestras alcanzaron una profundidad de secuenciación media de 53,7x (rango 38,5x - 80,9x, Tabla S1). Los datos de secuenciación de la línea celular se procesaron mediante el flujo de trabajo ilustrado en la Fig. 1. Brevemente, los archivos fastq se alinearon con el genoma de referencia canino (CanFam3.1) utilizando BWA y posteriormente se sometieron a un control de calidad siguiendo las mejores prácticas de GATK.

Para todas las herramientas de GATK, se utilizó la versión 4.1.3.0, a menos que se indique lo contrario. Las lecturas duplicadas se identificaron utilizando Picard Tools MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard). La recalibración de la puntuación de calidad de las bases (BQSR) se realizó utilizando un archivo VCF que contenía variantes de la línea germinal identificadas en 676 perros y otros cánidos.

Determinación de mutaciones somáticas simples.

Las mutaciones somáticas simples (variantes de un solo nucleótido (SNV) y pequeñas inserciones/deleciones (indels)) se detectaron utilizando un enfoque de llamada de consenso que combina Mutect2 y Platypus, los cuales permiten la llamada de variantes sin una muestra normal emparejada.

Mutect2 se ejecutó utilizando los scripts WDL de GATK Showcase disponibles en la plataforma de computación en la nube Terra. En primer lugar, se generó un panel de variantes normales utilizando datos WGS de la línea germinal de 23 perros de un conjunto de datos previamente publicado.

El VCF de las variantes de la línea germinal llamadas en 676 perros y otros cánidos se utilizó como referencia de la línea germinal, y un subconjunto de estas variantes se utilizó en el paso CalculateContamination.

Mutect2 se ejecutó con los argumentos adicionales "-downsampling-stride 20-max-reads-per-alignment-start 6-max-suspicious-reads-per-alignment-start 6". FilterMutectCalls se ejecutó con la opción "-run_orientation_bias_mixture_model_filter" ajustada a "True" y la opción "-min-median-read-position" ajustada a 10 pb.

Los cromosomas no anclados y mitocondriales se excluyeron de la llamada de variantes. Las variantes también se llamaron en las líneas celulares y en 23 BAMs WGS normales publicados utilizando Platypus (v. 0.8.1), con la bandera "-minReads" establecida en 3.

Empleamos un proceso de filtrado de varios pasos para identificar las llamadas de variantes de alta confianza y eliminar las variantes putativas de la línea germinal en la medida de lo posible. Como nuestro VCF de referencia de la línea germinal se había actualizado para eliminar dos individuos y todas las variantes no admitidas por los 674 individuos restantes, actualizamos el indicador de filtro en las llamadas de Mutect2 para reflejar estos cambios.

Paso 1: utilizando Bcftools (v. 1.12) se reajustó el indicador de filtro a "PASS" para cualquier variante en la salida de Mutect2 que se superpusiera a la posición de una variante eliminada de la referencia de la línea germinal y en la que el campo de filtro se estableciera como "línea germinal" solamente.

Paso 2: se utilizó el mismo enfoque para restablecer la bandera "alleleBias" en la salida de Platypus, ya que esto podría eliminar las variantes somáticas de baja fracción alélica. Paso 3: se creó un panel de normales para los datos de Platypus fusionando las llamadas de variantes de las mismas muestras de la línea germinal utilizadas en el panel Mutect2.

A continuación, se utilizó el comando isec de Bcftools para eliminar las llamadas de variantes en los datos de la línea celular de Platypus que se solapaban con la posición de una variante llamada en el panel de normales.

Paso 4: se eliminaron los sitios con una bandera de filtro no pasante utilizando Bcftools view. Paso 5: Bcftools isec se utilizó para mantener sólo las variantes llamadas tanto en Mutect2 como en Platypus para cada línea celular. Paso 6: Bcftools isec se utilizó para eliminar las variantes putativas de la línea germinal vistas en el VCF de referencia de la línea germinal, en el conjunto de SNPs de la línea germinal de Broad, o en el conjunto de SNPs de la línea germinal de Axelsson.

Paso 7: se utilizó la vista de Bcftools para eliminar las llamadas de variantes con una fracción alélica (AF) < 0,05, profundidad de lectura (DP) < 10, o menos de 3 lecturas que apoyaran el alelo alternativo. Paso 8: los sitios somáticos putativos restantes fueron regenotipados en 23 muestras normales de la línea germinal utilizando la herramienta Graphtyper, y las variantes encontradas en las muestras de la línea germinal fueron filtradas utilizando Bcftools.

Las variantes pasantes se anotaron utilizando SnpEff v5.0e. El paquete KaryoploteR, usando R (R3.5.0) fue implementado para identificar áreas de kataegis [35]. Se crearon gráficos de mutaciones con la herramienta lollipops. Los genes con mutaciones recurrentes fueron priorizados por su probable relevancia en el OS canino como se describió previamente.

Llamada de razas.

Los archivos BAM preprocesados se genotiparon en ubicaciones de variantes putativas de la línea germinal utilizando GATK HaplotypeCaller (versión 4.1.0.0) con el modo de ajuste de genotipado GENOTYPE_GIVEN_ALLELES. Se utilizó una versión anterior de nuestra referencia de línea germinal como lista de sitios a genotipar.

Esta referencia de línea germinal contenía 435 muestras (287 perros de raza pura, 6 perros con ascendencia desconocida, 100 perros indígenas o de pueblo de todo el mundo, 36 lobos y otros 6 cánidos salvajes). Para determinar la raza de cada línea celular, se creó el pipeline de llamada de raza seleccionando datos de genotipos disponibles públicamente (N = 1.212) [25, 26, 37] de 101 razas modernas con al menos 12 perros de raza pura por raza.

Se calculó la estadística F de Wright mediante el método de Hudson para cada raza utilizando 2.468.442 polimorfismos de nucleótido único bialélicos con <10% de genotipos perdidos. Se seleccionaron los SNPs con FST>0,15 en todas las comparaciones y se realizó una poda basada en LD en ventanas de 50kb (r2>0,5) para extraer 688.060 marcadores para la inferencia de la ascendencia global. Se fusionaron los genotipos de estos SNPs de las líneas celulares con los genotipos de las muestras de referencia, y luego se realizó la inferencia de ascendencia global utilizando ADMIXTURE [38] en modo supervisado (semilla aleatoria: 43).

Llamada a la firma mutacional.

Se utilizó la herramienta SigProfilerMatrixGenerator [39] para generar una matriz de contextos mutacionales variantes. A continuación, se utilizó la herramienta SigFit (v2.2) para identificar las firmas de sustitución de base única (SBS) de COSMIC v3 [41] presentes en los datos de la línea celular.

La matriz de oportunidades mutacionales para el genoma CanFam3.1 fue amablemente proporcionada por Adrián Báez-Ortega, de la Universidad de Cambridge, uno de los autores de SigFit. El ajuste se realizó con 10.000 iteraciones y 5.000 iteraciones de calentamiento, utilizando el modelo multinomial. Se seleccionaron las firmas que eran suficientemente mayores que cero (lo que significa que el extremo inferior del intervalo Bayesiano HPD era > 0,025 en cualquier muestra) y se volvió a realizar el ajuste utilizando sólo esas firmas.

Llamada de variantes estructurales.

Las aberraciones somáticas del número de copias (SCNAs) se detectaron utilizando el pipeline GATK somatic CNV, a través del espacio de trabajo Terra showcase WDLs. Se creó un panel autosómico de normales utilizando las 23 muestras de la línea germinal, y se crearon paneles sólo de hombres y sólo de mujeres para el cromosoma X. La opción "do_explicit_gc_correction" se estableció en "True" para la creación del panel. Como el sexo del donante no estaba anotado para muchas de las líneas celulares, determinamos el sexo basándonos en la relación de la profundidad media de las lecturas en los autosomas y en el cromosoma X (determinada por la herramienta GATK DepthOfCoverage).

Los ratios de cobertura X/autosoma entre 0,3 y 0,7 se consideraron masculinos, y los ratios entre 0,8 y 1,2 se consideraron femeninos. Se realizó la llamada de CNV, con los parámetros de suavización "kernel_variance_allele_fraction" y "kernel_variance_copy_ratio" establecidos en 0,8, y "num_changepoints_penalty_factor" establecido en 5. Los gráficos de CNV se rehicieron utilizando un archivo DICT ordenado para trazar los cromosomas en orden numérico y excluir los cromosomas no anclados y mitocondriales.

Las pérdidas de número de copias con un cambio de pliegue log2 de ≥ 0,4 (ganancia de una copia) o ≤ -0,9 (pérdida de dos copias) se consideraron en nuestro análisis. Se utilizó un script personalizado de Python para anotar el solapamiento de los segmentos de número de copias con los genes utilizando la anotación de genes caninos de Ensembl (Release 99).

Las variantes estructurales (SV) se llamaron utilizando la versión 1.6.0 de Manta. Las líneas celulares y las 23 muestras normales de la línea germinal se ejecutaron por separado utilizando la configuración de sólo tumor o línea germinal, según el caso. Los VCFs de salida se procesaron utilizando el script "convertInversion.py" proporcionado por Manta para convertir las inversiones al antiguo formato INV, en lugar del formato actual de final de ruptura (BND). Para mitigar la incidencia de falsos positivos cuando se analizan muestras derivadas de tumores no coincidentes, se realizaron múltiples pasos de filtrado.

Paso 1: se creó un panel de normales fusionando las llamadas SV de los 23 VCFs de la línea germinal con cada uno de los VCFs de la línea celular utilizando la herramienta Jasmine [45], usando los ajustes "-nonlinear_dist max_dist = 1000", "-output_genotypes", y "-keep_var_ids". Se utilizó un script personalizado de Python para añadir genotipos al campo "GT" de manera que los VCFs pudieran ser analizados por Bcftools.

Todos los genotipos se fijaron en 0/1. Para cada línea celular-panel de normales fusionado VCF, se extrajeron los IDs de variantes presentes en la línea celular pero en ninguna de las normales. Paso 3: utilizando Bcftools, se eliminaron los IDs de variantes presentes en las normales, así como las variantes en las que el campo de filtro no era "PASS", que estaban marcadas como "IMPRECISO", o en las que ni el soporte de lecturas emparejadas (PR) ni el de lecturas divididas (SR) era mayor o igual a 15. Se utilizó la herramienta "vcfbedsetfilter" de Jvarkit para marcar las variantes que se solapaban con las regiones centroméricas putativas (ventanas de 5000 pb que contienen ≥80% de repeticiones centroméricas, de https://github.com/Chao912/Mischka/CanFam3.1.centromere.bed).

Paso 4: las variantes restantes no filtradas se volvieron a genotipar en las muestras normales utilizando la herramienta Graphtyper, y cualquier variante con soporte en una muestra normal se eliminó utilizando Bcftools. Paso 5: los extremos de ruptura de translocación en los que se había filtrado un extremo en un paso anterior se eliminaron utilizando Bcftools.

  

Comparación con la literatura.

Identificamos cinco conjuntos de datos WES o WGS publicados de tejido canino OS (Sakthikumar, et al. [16], Gardner, et al. [18], Das, et al. [17], Chu, et al. [19]) o líneas celulares (Das, et al. [1]). Las llamadas de variantes se obtuvieron en formato VCF o tabular a partir de los datos suplementarios y se estandarizaron en formato VCF. Para minimizar la variabilidad debida a la anotación de genes y a la estrategia de secuenciación, limitamos nuestra comparación a las regiones codificantes (específicamente, las regiones CDS en la anotación canina Ensembl Release 99) utilizando la vista Bcftools, y reanotamos los VCF de cada estudio utilizando Snpeff.

Se excluyeron las variantes anotadas como de bajo impacto. Las variantes estructurales, incluidas las variantes de número de copias de Gardner, et al. y Chu, et al., se convirtieron de formato tabular a archivos bed. Las regiones superpuestas dentro de cada muestra se fusionaron utilizando Bedtools merge. Los segmentos de número de copias que se encontraron significativamente alterados de forma recurrente en Sakthikumar, et al. también se convirtieron a formato de cama para su comparación, pero no se pudo realizar un recuento de VNC a nivel de muestra.

Los genes solapados por una variante estructural se anotaron utilizando Bedtools annotate para contar el número de solapamientos de las regiones CDS en la anotación canina de Ensembl dentro de cada conjunto de datos. Debido a la falta de información sobre las coordenadas de los extremos de los puntos de rotura para las translocaciones en la literatura, no se pudo realizar una estandarización, y las translocaciones se compararon contando el número de veces que un gen determinado fue anotado como afectado en cada conjunto de datos.

Resultados.

Validación de la línea celular.

Se extrajo el ADN aislado de cada línea celular y se confirmó que era de origen canino y la línea celular de origen declarada mediante interrogación multiplataforma. El perfil de STR y la PCR específica de la especie confirmaron que el ADN secuenciado era canino, y los loci de STR eran coherentes con los comunicados anteriormente.

Además, la llamada de raza y la cobertura de secuenciación sobre el cromosoma X confirmaron el origen de la raza y el sexo de las líneas celulares tumorales cuando se disponía de datos previamente publicados, e identificaron esta información para varias líneas en las que dicha información no estaba disponible públicamente.

Es importante destacar que los perros de la aldea no tienen ascendencia de raza, lo que hace que el algoritmo de llamada de razas llame a muchas razas diferentes, cada una de las cuales se reporta como contribuyente de una pequeña fracción. Esto es especialmente importante para los conjuntos de datos de WGS en los que no se dispone de una muestra de referencia de ADN de la línea germinal, ya que las bases de datos existentes de variación de la línea germinal pueden no capturar con precisión el espectro de variantes normales de la línea germinal en estos perros, lo que da lugar a la aparición falsa de una mayor carga de mutaciones.

Por último, las llamadas de variantes de un solo nucleótido (SNV) entre las diferentes líneas celulares no fueron concordantes, lo que concuerda con la correcta identificación de las líneas celulares y la ausencia de contaminación cruzada entre ellas.

Variantes de un solo nucleótido en las líneas celulares del OS canino.

Las mutaciones sin sentido fueron las SNV codificantes más comunes identificadas en las líneas celulares del OS canino, con una fracción menor de mutaciones de cambio de marco y otros eventos disruptivos. No es sorprendente que se identificara una alta incidencia de variantes no codificantes, incluyendo variantes en la región de empalme y variantes en la región no traducida 3' y 5'.

Es probable que la falta de una referencia de línea germinal emparejada condujera a una mayor incidencia de llamadas falsas positivas en el genoma no codificante. Sin embargo, se reconoce cada vez más que las variantes en las regiones reguladoras contribuyen a la tumorigénesis. Aunque se desconoce la importancia de estas variantes, se justifica una mayor interrogación de las mutaciones no codificantes que pueden afectar a los genes impulsores del cáncer para empezar a atribuir importancia funcional a los elementos no codificantes en el SO.

A pesar de un filtrado exhaustivo, la carga mutacional en cada línea celular, calculada en 5,8 mut/Mb (rango 2,1-14,7, Tabla S5) fue mayor que la reportada previamente en tejidos primarios de OS caninos y humanos [18, 49]. Es probable que esto sea el resultado de un pasaje a largo plazo de las líneas celulares y de la falta de una muestra de referencia de línea germinal del individuo en el que se originó el tumor.

En las líneas celulares Gracie y OSCA-8 se identificaron regiones de hipermutación focal sugestivas de kaetegis. La línea celular HMPOS, que se originó en un perro de pueblo cuya ascendencia no está bien representada en nuestro panel de referencia, tuvo la mayor carga mutacional aparente.

En consonancia con las muestras de tejido primario del OS, las SNV codificantes más comunes fueron las mutaciones en TP53 (7/8; 88%), predominantemente compuestas por mutaciones de sentido erróneo con una menor incidencia de mutaciones de cambio de marco. El único otro gen con SNV codificantes identificado en al menos tres líneas celulares fue DST, un gen que codifica la distonina, una proteína de enlace del citoesqueleto.

Todos los demás SNV codificantes recurrentes eran privados de una o dos líneas celulares. Sin embargo, el espectro de SNVs observado era en gran medida representativo del identificado en las muestras de tejido primario del OS canino, con mutaciones implicadas en la reparación del ADN y el ciclo celular, genes reguladores epigenéticos y de la cromatina, y las vías de señalización PI3K y MAPK.

Comparamos nuestras llamadas de mutaciones somáticas simples con las reportadas previamente en muestras de tejido de OS canino WES/WGS. De los 3.836 genes con SNVs/INDELs notificados en al menos un tumor de OS en estos estudios, 272 (7%) también estaban mutados en al menos una línea celular. TP53 fue el más comúnmente mutado, tanto en la literatura (64%) como en nuestros datos (88%).

De los genes notificados en al menos el 5% de las muestras de OS, FSIP2 (13% de líneas celulares, 11% notificado en la literatura), TTN (3% de líneas celulares, 9% notificado en la literatura), ENSCAFG00000000632 (13% de líneas celulares, 7% notificado en la literatura), RYR2 (13% de líneas celulares, 5% reportado en la literatura), UNC80 (13% líneas celulares, 5% reportado en la literatura), LRP1B (13% líneas celulares, 5% reportado en la literatura), y XIRP2 (13% líneas celulares, 5% reportado en la literatura) fueron mutados en al menos una línea celular.

  

Varios genes comúnmente reportados como mutados en muestras de OS no tenían mutaciones somáticas simples en ninguna de las líneas celulares, más notablemente SETD2 (19% reportado en la literatura), así como NEB (12% reportado en la literatura).

También examinamos la concordancia de nuestras llamadas SNV e INDEL WGS con las reportadas previamente a partir de la secuenciación WES de las mismas líneas celulares. En general, una media del 49% de las variantes codificantes reportadas en WES de estas líneas celulares fueron confirmadas por WGS (rango 35% (McKinley)- 73% (OS2.4)).

Se evaluó el contexto trinucleotídico de los SNV, identificando la exposición a las firmas de sustitución de base única (SBS) de COSMIC v3 en las llamadas de SNV de las líneas celulares.

Las firmas SBS1 (la "firma del envejecimiento", asociada a la desaminación espontánea de la 5-metil-citosina), SBS5 (una firma "tipo reloj" de etiología desconocida), SBS8 (etiología desconocida), SBS9 (posiblemente debida a la hipermutación somática a través de la polimerasa eta en las células linfoides), SBS17a (etiología desconocida), SBS17b (asociada en algunos casos humanos a la quimioterapia con fluorouracilo y al daño por especies reactivas del oxígeno), SBS19 (etiología desconocida), SBS22 (exposición al ácido aristolóquico), SBS30 (deficiencia en la reparación de la escisión de bases, asociada a la pérdida de la función de NTHL1), SBS32 (asociada al tratamiento con azotiaprina), SBS35 (asociada a la quimioterapia con platino), SBS36 (deficiencia en la reparación de la escisión de bases, asociada a la pérdida de la función de MUTYH), SBS37 (etiología desconocida), SBS39 (etiología desconocida) y SBS40 (etiología desconocida, asociada al envejecimiento en algunos cánceres humanos) se identificaron en proporciones variables en las líneas celulares [41]. Las mayores contribuciones fueron las firmas SBS1, SBS40 y SBS5.

Las firmas SBS1, SBS5, SBS8, SBS17a, SBS17b, SBS30, y SBS40 han sido previamente reportadas en muestras de OS humano, mientras que las firmas SBS1, SBS8, SBS9, y SBS17b han sido reportadas en OS canino.

  

Variantes estructurales en las líneas celulares del OS canino.

Se identificaron VS, incluyendo deleciones, inserciones, inversiones, translocaciones y duplicaciones. La incidencia media de VS en este panel de líneas celulares fue de 1139 VS por línea celular, lo cual es notablemente más alto que lo reportado en los tejidos del OS y probablemente sea el resultado de la falta de una muestra de línea germinal compatible disponible. Los SV más comunes fueron deleciones y translocaciones cromosómicas complejas.

En consonancia con las VS reportadas en los tejidos primarios del OS, estaban presentes variantes estructurales sin número de copias que involucraban a DMD (4/8 (50%) líneas celulares), DLG2 (5/8 (62,5%) en este estudio), CDKN2A (6/8 (75%)), MAGI2 (7/8 (88%)), y MLLT3 (6/8 (75%)). En particular, se identificaron múltiples variantes que afectan a los genes epigenéticos y reguladores de la cromatina en todas las líneas celulares, lo que apoya las afirmaciones anteriores que implican alteraciones del paisaje epigenético en la biología del OS.

En 2/8 (25%) de las líneas celulares de este estudio se encontraron deleciones a gran escala que abarcan SETD2, mientras que otra línea celular tenía una duplicación que implicaba a SETD2. Por último, se identificaron SV recurrentes adicionales en NF1 (8/8 (100%)), NEDD4L, una ubiquitina ligasa E3 responsable de la homeostasis de PTEN (7/8 (88%)), así como en los genes de la desmetilasa de histonas KDM4A y KDM4C (alteración en uno de los dos presentes en todas las líneas celulares de este estudio), y KDM5A y KDM5C, (alteración en uno de los dos presentes en todas las líneas celulares de este estudio).

Variantes estructurales en las líneas celulares del OS canino.

Se identificaron VS, incluyendo deleciones, inserciones, inversiones, translocaciones y duplicaciones. La incidencia media de VS en este panel de líneas celulares fue de 1139 VS por línea celular, lo cual es notablemente más alto que lo reportado en los tejidos del OS y probablemente sea el resultado de la falta de una muestra de línea germinal compatible disponible. Los SV más comunes fueron deleciones y translocaciones cromosómicas complejas.

En consonancia con las VS reportadas en los tejidos primarios del OS, estaban presentes variantes estructurales sin número de copias que involucraban a DMD (4/8 (50%) líneas celulares), DLG2 (5/8 (62,5%) en este estudio), CDKN2A (6/8 (75%)), MAGI2 (7/8 (88%)), y MLLT3 (6/8 (75%)). En particular, se identificaron múltiples variantes que afectan a los genes epigenéticos y reguladores de la cromatina en todas las líneas celulares, lo que apoya las afirmaciones anteriores que implican alteraciones del paisaje epigenético en la biología del OS.

En 2/8 (25%) de las líneas celulares de este estudio se encontraron deleciones a gran escala que abarcan SETD2, mientras que otra línea celular tenía una duplicación que implicaba a SETD2. Por último, se identificaron SV recurrentes adicionales en NF1 (8/8 (100%)), NEDD4L, una ubiquitina ligasa E3 responsable de la homeostasis de PTEN (7/8 (88%)), así como en los genes de la desmetilasa de histonas KDM4A y KDM4C (alteración en uno de los dos presentes en todas las líneas celulares de este estudio), y KDM5A y KDM5C, (alteración en uno de los dos presentes en todas las líneas celulares de este estudio).

Del mismo modo, se identificaron diversas mutaciones y aberraciones del número de copias en los genes de la vía PI3K y MAPK, y todas las líneas celulares presentaban al menos una alteración en MAP2K1, MAP2K2, MAP2K4 o MAP2K5. En consonancia con la noción de que el OS es genómicamente heterogéneo, pocas aberraciones en genes individuales fueron recurrentes. Además, se identificaron pérdidas de número de copias, deleciones, inversiones y translocaciones en PTEN (5/8 (62,5%) líneas celulares) y NEDD4L (7/8 (88%)), lo que sugiere que la desregulación de la vía PI3K mediada por PTEN debe considerarse en el contexto de mutaciones concurrentes en NEDD4L, una ubiquitina ligasa E3 que regula negativamente a PTEN.

Discusión.

Las líneas celulares establecidas se han utilizado durante mucho tiempo para estudiar la biología del tumor y la respuesta a las terapias dirigidas. Más recientemente, la evaluación de un solo gen y la WES se han utilizado para trazar el paisaje mutacional de las líneas celulares de cáncer canino, proporcionando un recurso crucial para los estudios prospectivos.

Los datos de la WGS aquí reportados identificaron muchas mutaciones somáticas simples previamente publicadas en conjuntos de datos de WES. Sin embargo, el uso de la WGS permitió interrogar a las CNVs y a las SVs, permitiendo una comprensión más completa del espectro de la desregulación de las vías en las células del OS canino. Esto es particularmente importante en los cánceres genómicamente complejos, como el OS, donde las SNVs de punto caliente son menos comunes.

Mientras que muchas de las mutaciones somáticas simples conocidas asociadas al OS canino se conservaron entre las líneas celulares evaluadas en este estudio, algunas mutaciones típicamente encontradas en los tejidos primarios del OS estaban ausentes. Una característica sorprendente fue la ausencia de mutaciones somáticas simples en SETD2 en las líneas celulares utilizadas en este estudio. Sin embargo, SETD2 se eliminó en dos líneas celulares, y había mutaciones en las desmetilasas de lisina H3K36, lo que sugiere que los mecanismos que impulsan la desregulación de H3K36 son una característica fundamental del OS canino.

La concordancia con las llamadas SNV/INDEL entre las mismas líneas celulares incluidas en nuestro análisis y el análisis WES de Das, et al. fue moderada, y las discrepancias observadas se debieron probablemente a varios factores. Se sabe que los diferentes métodos de secuenciación y llamada de variantes tienen una baja concordancia. Además, el uso de distintos umbrales de filtrado de variantes y de diferentes bases de datos de la línea germinal probablemente dio lugar a la eliminación de conjuntos divergentes de mutaciones. Por otra parte, las presiones selectivas del cultivo in vitro y la inestabilidad genómica actual suelen impulsar el desarrollo de una importante heterogeneidad genética entre diferentes cepas de la misma línea celular

Se identificó una mayor carga mutacional en las líneas celulares del OS en comparación con los tejidos del OS. En parte, esto representa probablemente un error de tipo I debido a la falta de una muestra de línea germinal compatible. Esto es especialmente relevante en la línea celular HMPOS, que se determinó que procedía de un perro de pueblo basándose en nuestro algoritmo de llamada de raza y tiene una variedad de polimorfismos de un solo nucleótido no catalogados en nuestros archivos de recursos de variantes de línea germinal. Como la mayoría de las variantes genéticas son raras, y los perros de pueblo son más diversos genómicamente que los perros de raza pura, la falta de un normal emparejado probablemente dio lugar al mayor número de llamadas de variantes somáticas falsas positivas en la línea HMPOS.

La incorporación de un control de línea germinal emparejado se utiliza habitualmente para minimizar las llamadas de mutaciones falsas positivas en los conjuntos de datos de WES y WGS. Desarrollamos una línea de filtrado estricta tanto para las variantes somáticas simples como para las estructurales con el fin de reducir la aparición de falsos positivos debidos a la falta de una muestra de línea germinal emparejada. Los fundamentos de esta canalización son métodos establecidos en el campo; sin embargo, se aplicó de forma más estricta en este contexto. Por ejemplo, eliminamos cualquier variante que se superpusiera a una variante en nuestro recurso de línea germinal en lugar de exigir que se viera en dos o más individuos.

No exigimos que los alelos alternativos coincidieran, ya que encontramos casos en los que los alelos fueron anotados de forma diferente por distintas herramientas, a pesar de parecer la misma variante. Además, añadimos un paso de regenotipado con la herramienta GraphTyper, que identificó cualquier soporte para variantes somáticas putativas en nuestro panel de normales. Este paso fue especialmente útil para filtrar los INDELs en los que diferentes herramientas podrían situar las posiciones de inicio y final en lugares alternativos.

Creemos que este paso puede explicar algunas de las discrepancias en las llamadas somáticas simples reportadas en nuestro estudio y el estudio de Das, et al. para las mismas líneas celulares. No obstante, debido a las dificultades mencionadas y a la falta de validación ortogonal de nuestras llamadas de variantes, recomendamos que los investigadores validen las variantes de interés con una fracción alélica baja antes de realizar análisis posteriores adicionales.

En general, nuestros datos demuestran que el caótico paisaje genómico de las líneas celulares del OS canino coincide con el observado en el tejido tumoral primario del OS canino, definido por una alta complejidad estructural y pocas mutaciones puntuales recurrentes. No es sorprendente que algunos de los SNVs y SVs comunes encontrados en el tejido tumoral del OS no hayan sido identificados en este pequeño subconjunto de líneas celulares, probablemente debido a la evolución de las líneas celulares a lo largo del tiempo de cultivo.

Quizás lo más notable es que la conservación de las mutaciones en vías con relevancia funcional redundante subraya la probable importancia biológica de estas aberraciones en el OS. Este estudio destaca características importantes de cada una de estas líneas celulares, creando una hoja de ruta para los investigadores que persiguen la investigación de la medicina de precisión basada en hipótesis.

Por último, hemos detallado el uso de herramientas específicas y scripts modificados en este manuscrito para facilitar la implementación de esta línea de producción en otros conjuntos de datos WES/WGS caninos en los que no se dispone de muestras de referencia de la línea germinal. Además, como los pequeños cambios en la versión y los parámetros de ejecución de las herramientas computacionales pueden alterar notablemente los resultados, hemos puesto a disposición nuestras metodologías para facilitar el uso futuro de este enfoque en otros conjuntos de datos de secuenciación canina.

Conclusiones.

Las líneas celulares de osteosarcoma caninos son ampliamente representativas del paisaje genómico de los tejidos primarios de osteosarcoma caninos. La evaluación del panorama genómico, incluida la variación estructural, es importante para identificar con precisión la desregulación de las vías en los cánceres complejos cuando se utilizan líneas celulares en la investigación.

Cita: Megquier K, Turner-Maier J, Morrill K, Li X, Johnson J, Karlsson EK, et al. (2022) El paisaje genómico de las líneas celulares de osteosarcoma canino revela una complejidad estructural conservada y alteraciones de las vías. PLoS ONE 17(9): e0274383. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0274383

Editor: Douglas H. Thamm, Universidad Estatal de Colorado, ESTADOS UNIDOS

Recibido: 6 de junio de 2022; Aceptado: 25 de agosto de 2022; Publicado: 13 de septiembre de 2022

Por: Erik Farina (Etólogo Canino)

PSICOLMASCOT

Contacto: psicolmascot@gmail.com

Copyright © Por: Erik Farina - Psicolmascot  

Síndrome de Disfunción Cognitiva en Perros y Gatos

 

El Síndrome de Disfunción Cognitiva  o (SDC) es una enfermedad que implica la degeneración y pérdida de las células nerviosas dentro del cerebro en los animales domésticos más viejos, resultando en unos cambios de comportamiento. Estos cambios no son el resultado de cualquier otra condición médica, como un tumor cerebral, los tiroides, una enfermedad hepática o renal.

El cerebro está formado por más de 100 mil millones de células nerviosas. Cada célula nerviosa se comunica con la célula nerviosa adyacente para una liberación de una sustancia que estimula la siguiente célula.

Se piensa, que el inicio de este proceso degenerativo es debido a una disfunción de las mitocondrias y la acumulación de las sustancias tóxicas en el cerebro. (Las mitocondrias son las estructuras en todas las células que proporcionan energía a las células. Las células se mueren sin un suministro de energía suficiente.) La razón por la que aprovecha las mitocondrias está aún bajo investigación, y la respuesta puede conducir a un plan de tratamiento extraordinario para el SDC de los pacientes.

Aunque la edad es el mayor factor de riesgo para el desarrollo del SDC, no es el único factor implicado. Con estos signos neurológicos parecidos a la enfermedad del Alzheimer en los seres humanos, los animales domésticos de tan sólo ocho años de edad pueden presentar signos del SDC. En un estudio, el 28 por ciento de perros de 11 años a 12 años de edad y el 68 por ciento de 15 años a 16 años de edad, los perros tenían un signo menos en consonancia con el Síndrome de Disfunción Cognitiva.

Este problema crónico y progresivo tiene un impacto significativo en la vida de los animales de edad avanzada y sus propietarios. Los cambios que se producen en la conducta del perro o gato pueden ser muy frustrantes para el dueño. La terapia médica pretende reducir el impacto de estos problemas y retrasar el avance de la enfermedad.

Los signos clínicos de la SDC en los animales domésticos pueden incluir uno o más de los siguientes signos:

- Alteraciones en el sueño; presentando insomnio y deambulación nocturna.

- Pérdida de los hábitos de micción y defecación; el perro orina y defeca en casa; defeca u orina en la zona de descanso, sale a la calle pero elimina al volver a casa.

- Cambios en la memoria y el aprendizaje; tarda en reconocer a gente de la familia, no responde a órdenes conocidas, es incapaz de aprender tareas nuevas.

- Confusión o desorientación; va hacia el lado equivocado de la puerta, se pierde en lugares familiares.

- Cambios en la conducta social; ha descuidado su conducta de higiene, tiene problemas con la jerarquía social, tiene demasiada dependencia.

- Cambios en su actividad; presenta mirada fija o perdida, muerde objetos, deambula, presenta vocalización excesiva, su apetito se ha alterado, está apático.

- Ansiedad, irritabilidad; está más inquieto o agitado, se muestra agresivo lo que podría ser el reflejo de una falta de la capacidad de reconocimiento de los miembros de la familia.

Diagnóstico:

Lo que primero hay que determinar es si los cambios de conducta mencionados pertenecen al Síndrome de Disfunción Cognitiva o se deben a otro problema médico. Habrá que realizar un chequeo geriátrico que incluya analítica sanguínea completa y que descarte la existencia de patologías clínicas que justifiquen estos cambios de conducta.

Muchos de estos problemas no llegan a las consultas veterinarias porque los propietarios piensan que los cambios de conducta que tiene su animal son normales considerando su edad. Cuanto más avance la enfermedad menor respuesta obtendremos con el tratamiento llegando a agravarse los síntomas y deteriorando la calidad de vida del animal.

Tratamiento:

Lamentablemente no existe una cura para el SDC. Frecuentemente, voy a abordar este síndrome con múltiples modalidades de tratamiento para tratar de mejorar la calidad de la vida de la mascota. El tratamiento consiste en medicación, una dieta especial y cambios en el entorno de nuestros animales para adaptarlo a sus necesidades, como aumentar la frecuencia de salidas en el caso del perro para evitar una eliminación inadecuada (orinar en casa) o reubicar las cajas de arena de los gatos para facilitarles el acceso. No debemos castigarles ni exigirles la realización de conductas que antes efectuaban con absoluta normalidad. Es importante mantener un ambiente en casa tranquilo adecuado a la edad de los animales, ya que la falta de comprensión por parte de los dueños puede generar ansiedad que empeore su estado.

Por favor, póngase en contacto con su veterinario si su mascota está mostrando alguno de los signos clínicos anteriores de SDC. Los signos clínicos presentes en SDC también pueden estar presentes en otros procesos de la enfermedad. Es imprescindible que su veterinario pueda realizar un examen, análisis de sangre, análisis de orina y otras pruebas de diagnóstico físico completo (como radiografías o resonancia magnética) para confirmar el diagnóstico. Aunque no existe una cura para el presente Síndrome de Disfunción Cognitiva, hable con su veterinario acerca de las opciones terapéuticas disponibles para ayudar a su mascota olvidadiza, para que tenga una vida feliz. Con la investigación continuada, con suerte, pronto vamos a encontrar una cura para las mascotas con el Síndrome de Disfunción Cognitiva.

Consúltenos o pida una cita para su perro o gato si nota algún cambio: 674 41 52 33

Artículos relacionados: 

¿Cuánto tiempo viven los perros?

Síndrome de Disfunción Cognitiva Canina SDC - Perros Geriátricos

Por: Erik Farina (Etólogo Canino)

PSICOLMASCOT

Contacto: psicolmascot@gmail.com

Copyright © Por: Erik Farina - Psicolmascot  

Nueva investigación del cáncer canino

Un mapeo de genes asociados con el estudio de dos tipos comunes de cáncer en los Golden Retrievers podrían llevar a una mejor prevención y tratamiento de la enfermedad en los perros, así como en los cánceres similares en las personas.

La investigación publicada en la revista Genética a principios de este año, encontró que las variaciones en la secuencia del ADN en dos regiones separadas pero vecinas del genoma, están vinculadas a un mayor riesgo de linfoma y hemangiosarcoma en los Golden Retrievers. Estas variantes de ADN se asocian con cambios en la expresión de genes implicados en la activación y regulación de las células T del cuerpo, que son importantes para la respuesta antitumoral.

Perros individuales en cualquier raza determinada, tienen planos genéticos muy similares, a diferencia de la mayoría de las poblaciones humanas. Por esa razón, los científicos que buscan identificar marcadores para la enfermedad canina puede reconocer y descartar rápidamente los grandes tramos del ADN que son idénticos en los perros de la misma raza. Además, la selección artificial con el tiempo ha llevado a la intensificación de los factores de riesgo genéticos para ciertas enfermedades dentro de las razas.

"Necesitamos muchos menos perros para asignar una enfermedad de lo que lo haríamos con una población humana", dice Kate Megquier, V12, una estudiante de doctorado en el laboratorio de Lindblad-Toh del Instituto Broad de Harvard y el MIT y la Universidad de Uppsala en Suecia y una de los co-autoras del estudio. "Es como buscar una aguja en un pajar grande, pero más pequeño."

El estudio genético del hemangiosarcoma, un cáncer incurable de las células que recubren los vasos sanguíneos, también puede conducir a más información sobre el cáncer paralelo humano, el angiosarcoma. Mientras que el hemangiosarcoma afecta a uno de cada cinco Golden Retrievers, sólo una de cada un millón de personas tienen el angiosarcoma. Así que "simplemente no hay suficiente gente afectada para hacer este tipo de estudio genético con esa eficacia en los seres humanos", dice Megquier, quien tiene un DVM y un Master en ciencias biomédicas comparativas en el Cummings School.

Un hallazgo sorprendente

Unos investigadores veterinarios del Cummings School se unieron con científicos del Broad Institute, Universidad de Uppsala, Universidad del Estado de Carolina del Norte, la Universidad de Minnesota y la Universidad Estatal de Colorado en el estudio, que comenzó como dos proyectos de investigación independientes que buscaban en el linfoma de células B y hemangiosarcoma. Sin embargo, mientras los científicos del Instituto Broad analizaban los dos conjuntos de datos genéticos, se dieron cuenta de que los mismos cambios en la secuencia del ADN estaban asociados con ambos tipos de cáncer.

Ese hallazgo fue inesperado. Aunque los dos son cánceres del sistema circulatorio, el hemangiosarcoma y el linfoma de células B son bastante diferentes, ya que se producen en diferentes tipos de células en el cuerpo, dice Megquier.

El Hemangiosarcoma puede ocurrir en cualquier órgano, más comúnmente el bazo o el corazón, y el cáncer puede ser letal cuando los tumores llenos de sangre se rompen, causando una hemorragia. El linfoma, uno de los cánceres más comunes en los perros y personas, se desarrolla a partir de los glóbulos blancos, llamados linfocitos, que ayudan a defenderse de las infecciones.

Los tumores se encuentran generalmente en los ganglios linfáticos, a menudo primero se notan mientras son de rápido crecimiento con bultos en el cuello, en los hombros, en las axilas, en las rodillas y en la ingle. "Aproximadamente la mitad de los linfomas de células B en los perros tienden a ser un subtipo llamado Linfoma difuso de células B grande, y que es también uno de los subtipos más comunes de linfoma en los seres humanos", dice Megquier.

Antes de estos recientes descubrimientos, nadie sospechaba de que ambos tipos de cáncer tenían similitudes genéticas. Cómo estos cambios genéticos predisponen en los Golden Retrievers con el cáncer todavía está siendo investigado. Megquier teoriza que estos factores de riesgo genéticos pueden disminuir la capacidad del cuerpo para encontrar y eliminar las células tumorales, en lugar de aumentar la probabilidad de que las células normales se conviertan en cancerosas.

Mientras que en un animal sano el sistema inmune podría matar a las células potencialmente malignas antes de que tuvieran la oportunidad de proliferar, quizá "si tienes la mala suerte y tienes esas dos mutaciones [genéticas], las células inmunes no son tan buenas en eso ," dice Megquier.

Los investigadores planean utilizar sus resultados como plataforma de lanzamiento para identificar las mutaciones exactas responsables de los dos tipos de cáncer y sus consecuencias en el cuerpo. "Eso nos puede llevar a pensar en nuevas terapias, que es lo realmente emocionante", dice Megquier.

Los marcadores genéticos fiables podrían producir pruebas genéticas para identificar perros en mayor riesgo o para ayudar a los criadores a disminuir la incidencia del hemangiosarcoma con el tiempo. El cáncer tiene una inusualmente alta prevalencia en los Golden Retrievers, lo que sugiere que los genes relacionados pueden que hayan sido seleccionados de forma inadvertida durante más de toda la historia de esta raza.

"Estoy muy interesada en las autorizaciones de nuestros dos veterinarios y de los propietarios para tomar decisiones más informadas para el tratamiento de estos perros", dice Megquier.

Y esto también puede ser bueno para las personas, señala Megquier. Los veterinarios que están capacitados en la investigación biomédica "tienen una gran oportunidad de ser un puente, con lo que los descubrimientos nuevos en la clínica de los animales, sea de esperar también para las personas.”

Por: Genevieve

psicolmascot@gmail.com

Un Veterinario investiga nuevos tratamientos para las lesiones de la médula espinal en los perros

Tratamientos experimentales para las lesiones en la médula espinal en los perros son llevados a cabo en la Universidad Estatal de Iowa, que podrían algún día conducir a terapias más eficaces para los seres humanos que sufren de lesiones similares.

El Veterinario Nick Jeffery, profesor de neurología y neurocirugía en el la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Estatal de Iowa, dijo que los nuevos métodos de tratamiento que está estudiando en los perros pueden ofrecer una imagen más realista de cómo los seres humanos responderían mejor a los nuevos tratamientos que en los experimentos de laboratorio con ratas, un uso mucho más generalizado con un método de recopilación de datos sobre los nuevos procedimientos médicos.

Las condiciones de laboratorio estrictamente controladas para los roedores tienen poca semejanza con la realidad clínica de las lesiones de la columna vertebral humana. Pero los perros que sufren de forma espontánea lesiones de la médula espinal pueden ofrecer un coincidencia mucho más cercana, dijo el Dr. Jeffery.

“Las condiciones de laboratorio no siempre son útiles para una buena comprensión de las lesiones clínicas en humanos ", dijo el Dr. Jaffery." Pero algo de lo que vemos en los perros es un paso más cerca de cómo los seres humanos pueden responder a los nuevos tratamientos.”

El Dr. Jeffery ha estudiado atentamente los dos diferentes métodos de tratamiento experimentales. Lo primero el cultivo de las células implicadas que conectan el cerebro de un perro a su nariz y luego transfiriendo las células a la médula espinal. El Dr. Jeffery está estudiando el efecto de la condroitinasa, una enzima que puede romper el tejido de la cicatriz cuando se inyecta en la médula espinal de un perro paralítico.

Si bien los resultados de los estudios con las células no alcanzan el milagro, los perros paralíticos no lo dejan de ser de pronto y empiezan a correr por el parque otra vez más, los tratamientos suelen dar lugar a una gama más suave y más amplia de movimiento para los perros heridos, dijo el Dr. Jeffery. Y unos pocos casos individuales han demostrado unas mejoras espectaculares. "Es una mejora, pero no es magia", advirtió el Dr. Jeffery.

El Dr. Jeffery busca unas características específicas en los perros candidatos que pueden ser aceptados para poder recibir el tratamiento experimental. Para empezar, los candidatos deben ajustarse a un cierto rango de peso y sufrir de una lesión medular severa, cerca de la mitad de la espalda.

Más allá de eso, el Dr. Jeffery sólo se llevará a los candidatos que es seguro que no se beneficiarán de los tratamientos convencionales y de la terapia, el requisito le reduce en gran medida el grupo de sujetos elegibles. Es muy común entre los perros que los discos entre las vértebras se degeneren y tengan una ruptura, dijo el Dr. Jeffery. Sin embargo, la gran mayoría de los casos mejoran con el tratamiento tradicional. Son los perros que no mejoran los que quiere estudiar el Dr. Jeffery.

Una beca de investigación le permite al Dr. Jeffery poder administrar los tratamientos de forma gratuita a los dueños de los perros cuyos animales son aceptados, y él dijo que algunos propietarios viajan de estados tan distantes como Florida para participar en el estudio.

El Dr. Jeffery dijo que el trabajo vale la pena por dos aspectos muy importantes: se abre una nueva opción para los perros con lesiones de la médula espinal y que sienta las bases para una mejor comprensión de cómo los nuevos tratamientos podrían funcionar para los seres humanos con condiciones similares.

"Soy un creyente en la idea de que los veterinarios deberían estar trabajando en áreas importantes de la ciencia médica en beneficio de los animales domésticos y de las personas", dijo el Dr. Jeffery

Proporcionado por: Iowa State University

Copyright © Psicolmascot. Por: Erik Farina (Psicólogo Canino)

Contacto: psicolmascot@gmail.com

Copyright 2013 Psicolmascot. All rights reserved. This material may not be published, broadcast, rewritten or redistributed. - Derechos de autor 2013 Psicolmascot. Todos los derechos reservados. Este material no puede ser publicado, transmitido, reformado o redistribuido.