sábado, 7 de diciembre de 2013

El Estudio de los Secretos del Cerebro del Perro

Abstracto

Anteriormente, hemos demostrado la posibilidad del fMRI en dos perros despiertos y sin restricciones. Aquí, se determinó la replicabilidad y la heterogeneidad de estos resultados en otros 11 perros para un total de 13 sujetos. Basada en una anatómicamente colocada región de intereses, se comparó la respuesta del caudado a una señal con la mano indicando la disponibilidad inminente de una recompensa de comida a una señal con la mano indicando que no hay recompensa. 8 de 13 perros tuvieron una respuesta del caudado diferencial positivo a la señal que indica la recompensa. La respuesta media caudado diferencial fue de 0,09%, que era similares a las comparadas con la de un estudio humano. Estos resultados muestran que fMRI Canino es fiable y se puede hacer en los perros con un mínimo de estrés.

Introducción

A medida que las más antiguas especies domesticadas, las mentes de los perros, inevitablemente, han sido formadas por milenios de contacto con los seres humanos. Como resultado de esta evolución física y social, los perros, más que cualquier otra especie, han adquirido la capacidad de comprender y comunicarse con los humanos. Anteriormente, nuestro grupo publicó la primera demostración de fMRI en dos, perros despiertos sin restricciones. Con el uso de refuerzo positivo, capacitamos a los perros a ser muy cooperativa durante fMRI.

En nuestro primer experimento, se utilizó una tarea de condicionamiento instrumental sencillo en el que el comportamiento requerido era colocar la cabeza en un custom, mentonera anatómicamente diseñada y que no se moviera. Después de un intervalo variable de de aproximadamente 5 segundos, cualquiera de las dos señales con la mano separadas fue dado que indicaba la presencia o la ausencia de una recompensa de comida que el recibiría. La mano izquierda indica una recompensa de salchichas, mientras que las dos manos apuntando hacia la otra en sentido horizontal indicaban que no había ninguna recompensa. Las señales de con la mano fueron elegidas para ser fáciles de distinguir y se mantuvieron durante aproximadamente 10 segundos. De acuerdo con el error de predicción de recompensa (EPR) la teoría de la liberación de dopamina, se observó una activación significativa en el caudado ventral de los dos perros en respuesta a la señal con la mano que indica "la recompensa" en relación con la señal con la mano que indicaba "que no había recompensa"

El principal reto del fMRI en los perros viene de sujetos en movimiento. Históricamente, el enfoque usual había sido ya fuera anestesiado el animal o, como en las ratas y en los monos, inmovilizados. Está claro que si queremos comprender la cognición canina, la anestesia no es una opción. Por otra parte, la anestesia altera la función de la respuesta hemodinámica y puede arrasar en las estructuras subcorticales. La inmovilización es técnicamente posible, aunque éticamente objetable para un perro e impone condiciones emocionales no naturales que pueden sesgar la exactitud de un estudio de investigación. Por otra parte, como hemos demostrado anteriormente, la inmovilización es innecesaria para adquirir datos útiles del fMRI. En su lugar fue porque los perros siguen tan fácilmente las órdenes humanas, que pueden ser entrenados para entrar en un marco asociativo un escáner de resonancia magnética y sin restricciones mantienen su cabeza inmóvil, para que podamos llevar a cabo eficazmente los estudios del fMRI.

El objetivo del presente estudio fue doble: 1) determinar si nuestros resultados anteriores pudieran ser replicados, y 2) determinar la heterogeneidad de las respuestas del caudado en los perros a las señales con la mano humana que indicaban la presencia y ausencia de una recompensa. Aquí, se presenta los resultados en otros nueve perros y mejoras en la formación, la adquisición de las imágenes y los análisis de los datos del fMRI canino despierto sin restricciones.

Métodos: Declaración de Ética

Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El estudio fue aprobado por la Universidad de Emory IACUC (Protocolo # DAR-2001274-120814BA). Todos los propietarios de los perros dieron su consentimiento por escrito para participar en el estudio.

El Adiestramiento

Basándonos en nuestra experiencia inicial, se ha desarrollado un programa de adiestramiento para los perros que les enseña a entrar cooperativamente en el escáner de resonancia magnética . El programa se basa en la aclimatación al ruido del escáner de resonancia magnética , pasar por el recinto estrecho del escáner y las vibraciones de operación y la configuración y el encadenamiento último de varios comportamientos necesarios. 

Para ello, hemos construido dos réplicas de resonancias magnéticas, cada una de las cuales consisten en un tubo de aproximadamente las mismas dimensiones que el agujero interior del actual Siemens MRI , una mesa de paciente , medidas portátiles y múltiples bobinas receptoras simulados que se adhieren estrechamente a las dimensiones de una bobina de cuello humano. También se construyó una mentonera patentada que facilita el confort y la colocación adecuada de los animales y que adaptamos el aparato por la singularidad de la anatomía canina. Una vez que los animales tuvieron la confianza y competencia en relación con todos los pasos preparatorios, demostrado por completar un MRI simulado en el aparato de reproducción, que entonces se realizaron exploraciones en vivo en el actual Siemens MRI .

Hemos recopilado grabaciones de audio digitalizadas de las diversas secuencias del escáner. Para ayudar en la desensibilización y la aclimatación necesaria a los ruidos del escáner, cuando los adiestrábamos, jugábamos con las grabaciones a través de un PA sistema dirigido hacia el simulador. Hemos verificado los niveles de presión de sonido con un medidor de decibelios de mano para confirmar que una vez finalizado el proceso de formación nos acercamos al nivel de 96 dB del escáner real. Localizamos simuladores de resonancia magnética en la casa de uno de los propietarios y en un centro de formación contratado. Proporcionamos bobinas receptoras de simulacros para todos los propietarios participantes para llevárselos a casa, lo que alentó el adiestramiento diario, adelantando logro de las metas, y mucho mejor permitió a los perros para que se sintieran cómodos con un componente clave del proceso en el ambiente que es más familiar para el perro.

Sólo el refuerzo positivo, en combinación con la formación del comportamiento, el acondicionamiento y el encadenamiento, se utilizaban en el proceso del adiestramiento. En primer lugar, los perros están entrenados para poner su cabeza y las patas en la bobina de la cabeza. A continuación, se les enseña a colocar la barbilla sobre un apoya-mentón colocado horizontalmente a través de la bobina de la cabeza y que mantuviéran esta posición hasta que se les diera una señal de liberación. El tiempo de aguante se aumentaba gradualmente hasta los 30 segundos. Cuando los perros eran capaces de hacer esto de forma consistente con el movimiento de la cabeza no discernible, estos estaban adiestrados para hacer esto llevando orejeras caninas, que se introdujeron inicialmente para los animales aparte del simulador de bobina.

Al mismo tiempo que las secuencias iniciales del adiestramiento, las grabaciones del ruido del escáner se introducen a un volumen bajo. Una vez que el animal queda condicionado a un volumen bajo, el volumen se incrementa gradualmente. Las grabaciones de ruido del escáner se introducen con un volumen bajo mientras que el perro permanece estacionaria en la bobina. Una vez que el perro muestra un comportamiento relajado, el volumen se incrementa gradualmente. 

Cuando los perros se sienten cómodos usando las orejeras en la cabeza de la bobina con el ruido del escáner de aproximadamente 90 dB, se crean después de entrar en el tubo de resonancia magnética que se coloca en el suelo. Posteriormente, la bobina de la cabeza simulada se coloca dentro del tubo. Después de que el perro esté haciendo constantemente su cabeza todavía en esta configuración, el aparato entero se levanta sobre una mesa a la altura de la mesa real del escáner del paciente. Los perros son adiestrados para subir los escalones en el tubo. Por último, se aumenta la distancia para que el perro trabaje lejos del guía.

Con una cuidadosa selección canina, algunos perros pueden completar la formación en apenas un par de semanas. Más comúnmente, hemos encontrado que entre 2 a 3 meses de adiestramiento con sesiones de prácticas supervisadas cada dos semanas conduce a una alta tasa de éxito en la primera sesión de digitalización. Hasta la fecha, hemos capacitado a 15 perros, y 13 de 15 (87%) han completado con éxito el análisis. Excepto por el primer perro (Callie), cuya digitalización se llevó a cabo por ensayo y error, diez de los otros 12 perros completaron la exploración en el primer intento. Los perros restantes se convirtieron en sensibilizados al ruido y se requiere aún más la desensibilización. Ambos tuvieron éxito en el segundo intento.

El Escaneo MRI

Todo el escaneado se llevó a cabo en un escáner de todo el cuerpo del Siemens 3T Trio. En lugar de la bobina de la cabeza de la jaula de pájaro utilizada en nuestro estudio anterior, hemos encontrado que el uso de una bobina de cuello estándar coloca el elemento activo más cerca del cerebro del perro. Aunque menos homogénea en la cobertura de la jaula, el elemento superior está en estrecha proximidad al cerebro del perro, que proporciona un superior relación de señal a ruido (SNR) del cerebro en comparación con la bobina de jaula de pájaros, especialmente en la parte dorsal de el cerebro (SNR ~ 40 vs 17 con la jaula de pájaro.) que es más importante, porque los hombros y el cuerpo del perro se encuentran fuera de la bobina, estamos menos limitados por el tamaño de tema. Podemos acomodar las cabezas más grandes simplemente bajando la mentonera.

El resto de la barbilla se construyó a partir de planchas firmes de espuma, que están pegadas entre sí para formar una pila. Los semicírculos se recortaron para que coincidieran con la forma del hocico del perro con la nariz corta a la rama de la mandíbula. Para fines de formación, una maqueta de madera contrachapada de la bobina del cuello se construyó para cada perro. A continuación, insertamos la barbilla de encargo del resto del perro dentro del diámetro interior de la bobina.

Al realizar un análisis real, inmediatamente antes de la exploración, jugamos grabaciones de audio de la secuencia de exploración pertinente a través del altavoz en la sala del escáner. A medida que el perro se instala en el escáner, aumentamos el volumen registrado para que coincida con el nivel de decibelios del ruido del escáner real. Durante la reproducción de un bucle continuo de la grabación, una vez que ajustamos el nivel del sonido entonces comenzamos la exploración real. Las grabaciones son muy eficaces en reducir al mínimo la respuesta de sobresalto que de otro modo resultaría de la aparición repentina de la exploración real. Una vez que comienza la exploración real, apagamos la grabación del escáner.

En primer lugar, la imagen de un solo plano sagital se adquiere como un localizador, que dura 3 segundos (secuencia SPGR, grosor de corte = 4 mm, TR = 9,2 ms, TE = 4,16 ms, flip = ángulo de 40 °, 256 × 256 matriz, FOV = 220 mm). El sonido del localizador tiende a ser la más sorprendente y desagradable para los perros. Esto se minimiza mediante la adquisición de un solo plano. Debido a que la mentonera centra el perro en la dirección izquierda o derecha, una sola imagen sagital es todo lo que es necesario para la planificación del campo de visión, para los análisis posteriores.

En las exploraciones funcionales, se utilizó un solo disparo de imagen plana echo (EPI) para adquirir volúmenes de 25 secuenciales rebanadas 3 mm con una separación de 10% (TE = 28 ms, TR = 1400 ms, flip = ángulo de 70 °, 64 × 64 matriz, FOV = 192 mm). (Los dos perros iniciales, Callie y McKenzie, fueron escaneadas en la bobina de jaula con 28 divisiones y un TR = 1610 ms. Huxley también fue escaneada en la jaula debido a la preferencia de formación.)

Los sectores se orientan dorsalmente al cerebro del perro (coronal al imán porque el perro se coloca 90 º de la orientación humana habitual) con la dirección de codificación de fase de derecha a izquierda. Se prefieren las exploraciones secuenciales para minimizar los desplazamientos entre planos cuando el perro se mueve. La brecha de las división 10% minimiza la diafonía para adquisiciones secuenciales. La codificación de fase izquierda a derecha minimiza las imágenes fantasma del cuello que de otra manera se solapan en el cerebro del perro.

El TR es tan corto como sea posible para adquirir suficientes divisiones para cubrir todo el cerebro de la mayoría de los perros, mientras que no tan cortos como para disminuir de manera significativa de la señal. Aunque quizás no tan significativo para el fMRI, el ángulo de inclinación fue todavía elegido para que coincida con el ángulo de Ernst para la materia gris. Para cada perro, dos pasadas de aproximadamente 400 volúmenes fueron adquiridos, con una duración de unos 10 minutos.

Después de las pistas funcionales, una imagen estructural en T2 fue adquirida con una secuencia de eco de espín turbo (25 divisiones de 2 mm, TR = 3940 ms, TE = 8,9 ms, ángulo de inclinación = 131 °, 26 trenes de eco, 128 × 128 matriz, FOV = 192 mm), que duró 24 segundos. Esta secuencia se ha optimizado para obtener un buen contraste entre la materia gris y blanca en el menor tiempo posible. Es importante destacar que, hay que señalar que, debido al bajo peso de algunos perros, la secuencia estructural puede exceder el límite de la FDA de SAR para los seres humanos.

Aunque no hay un límite de SAR para los perros, asumimos el mismo límite, como si fueran seres humanos (4 W / kg de media en todo el cuerpo para cualquier período de 15 minutos o 3 W / kg en la cabeza durante un período de 10 minutos). Disminuyendo el ángulo de cara es una manera eficaz para disminuir SAR. En nuestra cohorte, la RAE es típicamente 1.5-2 W / kg, pero ha sido tan alto como 3.97 W / kg en el perro más pequeño. Incluso en ese nivel, la exploración es sólo 24 segundos de duración que significa un aumento insignificante en la temperatura del tejido.

La grabación de los eventos

Los eventos de la prueba fueron registrados por un observador a través de una caja de botones compatible con cuatro botones de resonancia magnética. Estos eventos incluyen la aparición de las señales con la mano, desplazamiento, y la recompensa. Un ordenador portátil con Matlab (MathWorks) y Cogent (FIL, University College London) se conecta a través del puerto serie de la caja de botones, y se registra tanto la respuesta de la caja botón por el observador, así como los impulsos de la secuencia del escáner.

La Tarea

Se utilizó una tarea de condicionamiento instrumental sencillo en el que el comportamiento requerido era colocar la cabeza en la mentonera y no moverse. Después de un intervalo variable de aproximadamente 5 segundos, se le dio una señal con la mano que indica la presencia o ausencia de un premio de comida que se recibiría. La mano izquierda indica una recompensa de comida (un pequeño trozo de salchicha), mientras que las dos manos apuntando hacia la otra en sentido horizontal indicando que no había ninguna recompensa. Las señales con la mano fueron elegidas para ser fáciles de distinguir y se mantuvieron durante aproximadamente 10 segundos. El perro tenía que continuar sosteniendose aún durante este período.

Los perros habían sido ampliamente adiestrados en estas señales con la mano en el simulador antes de la última sesión de exploración. Debido a que los perros habían sido adiestrados para entrar en la bobina de la cabeza en una posición "esfinge", el controlador dio las señales de mano del extremo de la cabeza del escáner, frente al perro. Se realizaron 20 repeticiones de cada tipo de ensayo (un total de 40 ensayos), dividido en partes iguales entre dos pasadas funcionales. Los tipos de la prueba eran al azar en orden. Para asegurarse de que los perros prestaban atención a la aparición de la señal con la mano, se mantuvo la señal con la mano de la recompensa hasta que el alimento ha sido efectivamente entregado.

Esto impidió que los perros asociaran el desplazamiento de la señal con la comida. La recompensa de alimentos siempre se entrego en la mano derecha, y fue entregado directamente a la boca del perro al llegar a la cavidad. El consumo de alimentos dio lugar a movimientos de la cabeza, pero los perros fueron adiestrados para reemplazar a la cabeza en la mentonera y esperar la señal de la mano siguiente. La señal de la mano siguiente comenzó aproximadamente 5 segundos después de que el perro se había reemplazado la cabeza en la mentonera. Este intervalo permitido durante varios TRs volvieron a estabilizar la señal del MR. Los escáneres durante el período de consumo de alimentos fueron normalmente descartados del análisis.


Preprocesamiento y análisis

Todos los datos funcionales serán pre-procesadas usando el AFNI y sus funciones asociadas. Los archivos DICOM de las pistas del PAI se convirtieron primero en formato AFNI BRIK con el comando to3d. Las pistas del PAI se sometieron a una corrección de movimiento utilizando transformación afín 6 parámetro de 3dvolreg, empleando un método de dos pasos, donde los resultados de primer paso en una alineación bruta y el segundo pase un buen alineamiento. Todos los volúmenes se han ajustado a un volumen de referencia, que era o el primer volumen de la primera pasada, o un volumen seleccionado de forma manual desde la primera pasada sobre la base de una inspección visual.

Tres métodos diferentes fueron utilizados para censurar los volúmenes con los artefactos de movimiento restantes. En primer lugar, 3dToutcount se utilizó para la producción de la fracción de los voxels de valores atípicos para cada volumen. 3dToutcount define valores atípicos como los voxels cuya intensidad de la señal se desvía de la desviación absoluta media de la serie temporal. Los volúmenes con una fracción más grande que uno corto (0,1 ó 0,001, dependiendo del perro) fueron censurados en el análisis estadístico.

En segundo lugar, se utilizó 1d_tool.py para censurar volúmenes basados en la cantidad de movimiento estimado emitida desde 3dvolreg. 1d_tool.py calcula la derivada de la serie de tiempo restando de cada volumen del volumen anterior, así como la norma euclidiana de los parámetros de rotación y traslación emitidas desde 3dvolreg. Se utilizó una norma de corte euclidiano que variaba entre 1 y 1,6, dependiendo de la materia, para generar el archivo de censor.

Por último, se inspeccionaron visualmente la serie resultante tiempo con los volúmenes censurados desde 3dToutcount y 1d_tool.py y censurados los volúmenes que mostraban artefactos obvios. En promedio, el 43% de los volúmenes totales del PAI se mantiene para cada sujeto (que van desde 30% - 59%).

Las imágenes del PAI se alisan y se normalizaron al % del cambio de señal. El suavizado se aplicó mediante 3dmerge, con un núcleo de 6 mm en el Ancho Total de la mitad del máximo (FWHM). El tamaño del núcleo de suavizado se eligió basándose en el tamaño previsto de la respuesta estriatal a la predicción de recompensa señal de la mano. Para convertir los valores de intensidad de señal en% cambio de señal, se utilizó 3dcalc restar y dividir por la imagen EPI media (generada a partir del 3dTstat opción media). Estos valores se convirtieron después en porcentajes multiplicando por 100. Estas imágenes del PAI escala resultantes se introducen en el Modelo Lineal General.

Para cada tema, un modelo lineal general se estimó para cada voxel utilizando 3d deconvoluido. Los regresores relacionados con las tareas en este modelo incluyen, 1) Señal con la mano con la recompensa, 2) señal con la mano sin la recompensa, y 3) el consumo de recompensa. Los tres regresores relacionados con las tareas eran las funciones de impulso, es decir, su duración no fue modelada. En nuestro experimento original, se observó que la función de la respuesta hemodinámica (HRF) en el caudado alcanzó su punto máximo entre los 3 y 6 segundos después de la aparición de la señal de la mano, que es similar al caudado HRF humana. En base a esto, todos los eventos fueron convolucionados con una sola función gamma. Se utilizó la función de GAM en 3ddeconvolve de AFNI con los parámetros por defecto, lo que resulta en un HRF que culmina a los 5 segundos. Para ayudar a controlar el movimiento del sujeto, 6 regresores de movimiento emitidos desde 3dvolreg también fueron incluidos en el modelo. Para dar cuenta de las diferencias entre las pasadas, se incluyó un término que derivaba constantemente y una lineal para cada ejecución.

Debido a la heterogeneidad en la forma del cerebro canino y el tamaño esto impide la normalización de grupo, se realizó un análisis de retorno de la inversión individual en base. Para cada perro, dos esférica ROI (radio de 6 mm) se encuentra anatómicamente en la imagen media EPI y correspondió a la caudado ventral izquierda y derecha. Aunque el caudado no es claramente visible en las imágenes de EPI, podemos aproximar visualmente su anterior ubicación para el "chevron" creado por la cápsula interna y posterior al bulbo olfatorio y por referencia a la imagen estructural del perro. Después, la diferencia media en respuesta a la señal con la mano de la recompensa contra la señal con la mano sin la recompensa, se calculaba a partir de estas regiones de interés. Los valores de retorno de la inversión se analizaron con un modelo de efectos mixtos en SPSS 21 (IBM). Este modelo incluyó los efectos fijos de señal con la mano (la recompensa, no hay recompensa) y lateral (izquierda, derecha), x lado de la señal como un efecto repetido, y el perro como un efecto aleatorio.

Los Resultados

Al contrastar la señal con la mano con la recompensa a la señal con la mano sin ninguna recompensa, 8 de cada 13 perros (62%) mostraron una señal diferencial positiva en el caudado (un promedio de más izquierda y derecha). Sin embargo, un perro - Caylin - era un caso atípico negativo basada en la prueba de Grubbs (Z = 2,37) y, posteriormente, fue excluido de los nuevos análisis. Con el modelo de efecto mixto de los perros restantes, señal con la mano fue significativa [F (1,36) = 4,81, p = 0,035], pero el equipo no era [F (1,36) = 0,01, p = 0,940]. La comparación por parejas de la recompensa contra la señal sin la recompensa mostraron una diferencia media de 0,093% (0,042% sí), lo que indica un efecto positivo consistente con nuestro estudio original.

La heterogeneidad de los sujetos de estos resultados es tan interesante como la replicabilidad. De manera similar a los estudios en los humanos, toda la activación del cerebro mostró diversos patrones y la intensidad de la actividad a través de la corteza en cada uno de los sujetos. Pero dentro de las regiones de interés caudado, no hubo diferencias significativas en la izquierda, de la activación de la derecha. De hecho, la mayoría de los perros tenían niveles similares de activación de ambos lados. Un perro tenía una activación diferencial positivo a la derecha y negativo a la izquierda, que, cuando se promediaron ambos lados juntos dio como resultado una "desactivación" aparente a la señal con la mano de la recompensa. Esto parece ser el patrón de los pocos perros que tenían desactivaciones aparentes, con el valor medio se conduce negativa por la izquierda o caudado derecho, con el otro lado es positivo o cercano a cero.

CONTINÚE..


Por: Gregory S. Berns - Andrew Brooks - Mark Spivak - Trad; Erik Farina

Copyright © Psicolmascot. Por: Erik Farina (Psicólogo Canino)


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