domingo, 12 de enero de 2014

El microbioma en los perros sanos y alérgicos

Los cambios en las poblaciones microbianas en la piel de los animales tradicionalmente han sido evaluados utilizando técnicas convencionales de microbiología. La secuenciación de los genes bacterianos 16S rRNA ha revelado que la piel humana está habitada por un microbioma muy diversa y variable que no hubieran sido previamente demostrada por los métodos de cultivo. Los objetivos de este estudio fueron describir el microbioma habitan diferentes áreas de la piel canina, y para comparar el microbioma de la piel de perros sanos y alérgicos.

El ADN extraído a partir de los hisopos superficiales de la piel de los perros sanos (n = 12 ) y alérgicos ( n = 6 ) de diferentes regiones de la piel con pelo y las superficies mucosas se utilizaron para 454 pirosecuenciaciónes del gen 16S ARNr . La principal coordinación del análisis de agrupación reveló para las diferentes zonas de la piel a través de todos los perros, con algunos sitios de la mucosa y de las regiones perianales agrupamiento por separado de los lugares de la piel con pelo. El análisis de rarefacción reveló una gran variabilidad individual entre las muestras obtenidas de los perros sanos y entre las diferentes zonas de la piel .

La mayor riqueza de especies y la diversidad microbiana se observaron en las muestras de piel con pelo en comparación con las superficies mucosas o uniones mucocutáneas . En todas las regiones analizadas , la más abundante filum y familiares identificados en las diferentes regiones de superficies de la piel y las mucosas estaban con Proteobacteria y Oxalobacteriaceae . La piel de los perros alérgicos tenía menor riqueza de especies en comparación con los perros sanos . Los perros alérgicos tenían proporciones más bajas de la Betaproteobacteria Ralstonia spp . en comparación con los perros sanos .

El estudio demuestra que la piel de los perros está habitada por muchas más ricas y diversas comunidades microbianas de lo que se pensaba, basado en los métodos de cultivo utilizado. Nuestros datos de secuencia revelan una gran variabilidad individual entre las muestras obtenidas de los distintos pacientes. Las diferencias en la riqueza de especies también se observó entre los perros sanos y alérgicos, los perros alérgicos tenían menor riqueza de especies en comparación con los perros sanos.
 
El cuerpo humano está colonizado por una amplia variedad de microorganismos, incluyendo bacterias, hongos, y virus. Estos microorganismos residentes viven en una relación simbiótica con su anfitrión. Sin embargo, un desequilibrio de este microbioma puede resultar en daños a su huésped. La mayoría de los microorganismos que componen el microbioma de piel humana no han sido cultivadas o aisladas hasta la fecha. Métodos moleculares basados recientes, lo más comúnmente es el gen 16S ARNr, ahora han permitido caracterizar estas comunidades microbianas altamente complejos en diferentes sitios del cuerpo humano. En la medicina veterinaria, la mayor parte del conocimiento sobre los pequeños microbioma animal están basados en el 16S rRNA que está en las comunidades microbianas presentes en el tracto gastrointestinal.

Los cambios en las poblaciones microbianas de la piel de los animales que tradicionalmente han sido evaluadas utilizando técnicas de microbiología convencionales, tales como los métodos de cultivo y bioquímicos. La secuenciación de los genes bacterianos 16S rRNA ha puesto de manifiesto que la superficie de la piel de los seres humanos está habitada por una microbiota muy diversa y variable que no ha sido previamente demostrada por métodos basados en la cultura. Estos estudios han descrito la composición microbiana en diferentes regiones de la piel, con Propionibacterium spp. predominante en áreas sebáceas, Staphylococcus y Corynebacterium spp. predominando en las zonas húmedas y los organismos gram negativas (por ejemplo, la Betaproteobacteria) colonizando las áreas de la piel seca, como el antebrazo o la pata.

Por otra parte, la edad ha demostrado influir en el microbioma de la piel, como los niños que tienen una diferente flora de la piel que los adultos. Es necesario realizar estudios similares en los perros y otras especies animales para investigar mejor el papel del microbioma de la piel en la salud y la enfermedad. Existen pocos reportes sobre el microbioma de la piel en los perros. Estos estudios, sin embargo, sólo se investigaron algunos sitios de la piel en un pequeño número de perros, o que se centraron principalmente en las relaciones humanas y del perro.

La microbiota normal de la piel es necesaria para la función óptima de la piel, la modulación de la respuesta inmune innata y la prevención de la colonización con los microorganismos potencialmente patógenos. En muchas enfermedades de la piel, no queda claro si algunas enfermedades de la piel son causadas por alteraciones en el microbioma cutánea o si estas alteraciones son consecuencia de la propia enfermedad de la piel. En los seres humanos con dermatitis atópica (DA) y la psoriasis, se han propuesto los cambios en la microbiota cutáneas que se debe a diferentes mecanismos, tales como una función de barrera epidérmica alterada, el receptor de tipo toll de 2 mutaciones, los niveles reducidos de péptidos antimicrobianos, y / o un aumento de la expresión de las proteínas de la matriz extracelular.

Estos mecanismos propuestos se cree que son responsables de un aumento de la prevalencia del estafilococos spp. y la susceptibilidad a las infecciones estafilocócicas en pacientes humanos con AD. También se ha demostrado que en los seres humanos con AD, la infección con estafilococos aureus que se correlaciona con la gravedad clínica de la enfermedad. Además, los estudios de metagenómica han mostrado que S. aureus domina lesiones de la piel en pacientes humanos con AD, aunque no hay cambios en la abundancia relativa de S. aureus se identifican en las muestras nasales.

Al igual que los humanos, los perros desarrollan AD con hipersensibilidad a los alérgenos ambientales como los ácaros del polvo doméstico y / o alérgenos alimentarios. El AD se considera una de las enfermedades más comunes de la piel crónicas en los perros, que afecta aproximadamente al 10% de los perros. En la mayoría de los perros con AD, las lesiones primarias de la piel se caracteriza por máculas y placas eritematosas intensamente pruriginosas y los sitios más comunes de lesiones son las patas anteriores y posteriores, las axilas y el abdomen (región inguinal). Los perros con AD a menudo sufren de infecciones bacterianas y / o fúngicas secundarias, más comúnmente debida a Staphylococcus pseudintermedius; estas infecciones resultan en una exacerbación de lesiones de la piel con el desarrollo de pápulas, pústulas, costras, y la alopecia.

El objetivo principal de este estudio fue evaluar y describir la diversidad del microbioma que habitan en diferentes áreas de la piel canina, incluyendo las superficies de las mucosas, uniones mucocutáneas y sitios de la piel conn pelo. Un objetivo secundario de este estudio fue comparar el microbioma de la piel de perros sanos con la de los perros con EA. Al igual que en los estudios que se describen en las personas, que demuestran que el microbioma de la piel en los perros es muy variable en las diferentes zonas evaluadas de la piel, y que la diversidad de la microbiota de la piel en los perros atópicos se reduce en comparación con los perros sanos.

Este estudio ha sido aprobado por la Texas A & M University Universidad (TAMU) Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión. El consentimiento informado para inscribirse casos clínicos en el estudio se obtuvo de cada cliente.

Doce perros sanos se inscribieron en este estudio; su edad osciló entre los 8 meses y los 13 años (una media de 7,5 años). Hubo 6 perros machos (1 intacto y 5 castrados, 3 Labradores, 1 Boston Terrier, 1 Carlino y 1 Pastor Australiano) y 6 perras hembras (5 esterilizadas y 1 intacta; 3 Labradores, 1 mestiza, 1 y 1 Pitbull Terrier) . Nueve perros se mantuvieron principalmente en el interior, dos perros se mantuvieron tanto en interiores como al aire libre, y un perro se mantuvo exclusivamente en el exterior. Todos los perros que cohabitaban con otros animales (perros y / o gatos). Los animales sanos del estudio no tenían hallazgos históricos o clínicos sugestivos de enfermedad alérgica en la piel, ni fueron tratados con antibióticos, antiinflamatorios o fármacos inmunosupresores durante al menos 6 meses antes de la recogida de las muestras.

Los Perros Alérgicos

Seis perros que estaban de entre 2 a 14 años (una media de 6,5 años de edad) con enfermedades alérgicas de la piel también se inscribieron en este estudio. Todos eran de raza pura (1 Boston Terrier, 1 Caniche, 1 Pastor Alemán, 1 Pitbull, 1 pastor australiano y 1 Golden Retriever ), 4 machos estaban castrados y 2 hembras estabann esterilizadas. Cinco perros estaban diagnosticados con AD utilizando métodos de diagnóstico y terapéuticos estándar, incluyendo el cumplimiento de por lo menos cinco de los criterios de Favrot y la exclusión de otras dermatosis pruriginosas. (por ejemplo, acariasis sarcóptica, dermatitis alérgica por pulgas, y las reacciones adversas a los alimentos cutáneas)

Un perro fue diagnosticado con dermatitis atópica como, exhibió signos de AD pero con una hipersensibilidad mediada por IgE a los alérgenos ambientales que no se pudo demostrar por cualquier alergeno intradérmica específico o pruebas serológicas. Los perros alérgicos se mantuvieron principalmente en interiores, pero sí recibieron la prevención mensual de adulticida par las pulgas. Todos los perros que co-habitan con otros animales (perros y / o gatos). Para ser incluidos, los perros no pueden mostrar signos clínicos evidentes de infección bacteriana de la piel o dermatitis Malassezia, ni haber recibido antibióticos sistémicos durante al menos 30 días, o tomar un baño durante al menos 7 días antes de la toma de muestras.

Tres perros estaban recibiendo dosis antiinflamatorias de los glucocorticoides (administración en días alternos) o el fármaco inmunomodulador ciclosporina (modificada), y tres estaban siendo tratados con inmunoterapia específica con alergenos (SAIC). Dos de los perros alérgicos (perros 13 y 18) no habían recibido glucocorticoides en los 6 meses previos a la recogida de muestras, la ciclosporina (perro 13 recibió ciclosporina 4 años antes del estudio), o SAIC. Aunque los perros no tenían lesiones de la piel, más expuesto leve a moderada prurito en el momento del estudio.

La recogida de muestras

Se recogieron muestras de 12 lugares de la piel de 12 perros sanos, para un total de 144 muestras. Los sitios de la piel incluyen la mucosa nasal derecha, la nariz dorsal derecha, comisura labial derecha, la conjuntiva derecha, zona periocular derecha, canal del oído derecho, pabellón auricular cóncavo, zona lumbar dorsal, axila derecha, la ingle derecha, dorsal derecha piel interdigital entre los dígitos 4 y 5 de la pata derecha delantera, dorsal y área perianal. Se recogieron muestras de 4 puntos de la piel de 6 perros alérgicos para un total de 24 muestras. Los espacios pertenecientes la axila derecha, la ingle derecha, mucosa nasal derecha, y la derecha de la piel interdigital dorsal entre los dígitos 4 y 5 de la pata delantera derecha.

Para cada sitio de la piel, se utilizaron dos aplicadores de torunda de cultivo estéril (BD Biosciences, NJ). Cada aplicador hisopo se frota sobre la piel 40 veces, mientras que gira cada hisopo por cuarto por cada 10 golpes. Los dos hisopos fueron almacenados en el mismo tubo debidamente etiquetado y refrigeradas a 4 ° C hasta su posterior análisis.


La extracción de ADN y la Pirosecuenciación

El ADN genómico fue extraído de cada conjunto de torundas estériles recogidos de cada sitio de la piel usando el kit de aislamiento de ADN suelo Mobio de alimentación ( Mobio Laboratorios ) , según lo recomendado por el fabricante . Bacterial FLX- titanio amplicón pirosecuenciación etiqueta codificada ( bTEFAP ) con base en la región V1- V3 (posición de E. coli 27-519 ) del gen 16S rRNA se realizó en el Laboratorio de ADN MR, Shallowater , TX, EE.UU. , como se describió anteriormente , con cebadores directos 28F : GAGTTTGATCNTGGCTCAG y revertir 519R : GTNTTACNGCGGCKGCTG [ 23 ] . Secuencia de datos en bruto se proyectaron , recortado, se filtra, se denoised y quimera agotan con la configuración predeterminada utilizando el software QIIME tubería versión 1.6 . Las unidades taxonómicas operacionales se definen como secuencias bacterianas con al menos 97 % de similitud utilizando QIIME . Las secuencias obtenidas en este estudio han sido depositadas en el NCBI Short Lee Archive número de acceso SRP028524 .

El análisis de los datos

Un total de 779.812 secuencias fueron amplificados de todas las muestras de piel de los perros sanos y alérgicas . Una media de 4.754 secuencias (mediana de 3450 secuencias) se obtuvieron por muestra de cada sitio de la piel , con un mínimo de 195 secuencias y un máximo de 55.956 secuencias por sitio . Debido a la profundidad de secuenciación desigual entre los diferentes sitios y muestras , y para normalizar el recuento de secuencias a través de muestras , se realizó el análisis de datos en un subconjunto seleccionado de forma aleatoria de 1.000 secuencias por muestra. Ciento treinta muestras de los perros sanos y 17 muestras de los perros alérgicos tenían más de 1.000 secuencias , y se consideraron para el análisis de datos .

Todas las muestras con menos de 1.000 secuencias por muestra se eliminaron del análisis adicional . La diversidad alfa [es decir , la rarefacción , el número de diferentes especies ( riqueza de especies) por muestra ] , y la diversidad beta (es decir, las comunidades microbianas similitud ) se calcularon y se representan mediante el software v1.6 QIIME medidas. En las muestras de los perros sanos que tenían un mayor número de secuencias , la rarefacción también se realizó en un subconjunto seleccionado aleatoriamente de 3.000 secuencias , para evaluar la riqueza de especies en mayor profundidad secuenciación ( número de veces que un sitio genómico específico es secuenciado en una ejecución de secuenciación ) , y se evaluaron un total de 89 muestras.

Se utilizó la distancia UniFrac análisis métrica basada en la filogenia investigar las diferencias en las comunidades microbianas entre sitios de la piel , así como entre los grupos ( sanos contra los alérgicos ) . Tanto el ponderado , que representa la abundancia relativa de secuencias en diferentes entornos , y no ponderado , que no tiene en cuenta la abundancia relativa , se realizaron análisis de UniFrac .

El análisis de las similitudes de función ( ANOSIM ) en el paquete de software estadístico PRIMER 6 ( PRIMER- E Ltd. , Luton, Reino Unido ) se utilizó en la matriz de la distancia ponderada y no ponderada UniFrac para determinar si hay grupos de muestras contenían significativamente diferentes comunidades bacterianas. Debido a un ajuste para comparaciones múltiples , los valores de p iguales o superiores a 0.001 se consideraron para la significación . Los valores de R de la ANOSIM prueba estadística proporcionan una estimación de la magnitud del efecto y rango de 1 a -1. R Los valores más cercanos a 0 indican que no existen diferencias entre las distintas zonas de la piel , mientras que los valores cercanos a 1 indican que existen diferencias entre las zonas de la piel .

Las diferencias en las proporciones de los taxones de bacterias ( porcentaje de secuencias totales) entre los diferentes sitios, y entre perros sanos y alérgicos se probaron para la normalidad , y puesto que los datos no se distribuyen normalmente , se realizó una prueba de Kruskal -Wallis no paramétrico , utilizando el paquete estadístico JMP10 (SAS, Marlow , Buckinghamshire ) . Resultantes p-valores fueron corregidos para comparaciones múltiples utilizando el Benjamini y Tasa de Falso Descubrimiento de Hochberg [ 27 ] . Un ajustado, p < 0,05 fue considerado para la significación estadística .

Los Resultados

Microbioma de la piel de perros sanos

Piel composición microbiana de los perros sanos.

Las similitudes en la composición de la comunidad microbiana entre las muestras se evaluaron con las cifras de distancia UniFrac sin ponderar y ponderado. El UniFrac métricas no ponderado fue significativamente diferente utilizando el análisis de ANOSIM, cuando las superficies de la mucosa y zonas mucocutáneas donde la comparación con los sitios de la piel con pelo. Sin embargo, cuando se considera la métrica UniFrac ponderada, que da énfasis a la abundancia de unidades taxonómicas operacionales (especies bacterianas), menor número de sitios se consideraron significativamente diferentes.

Las principales parcelas coordenadas del análisis se construyeron utilizando la UniFrac no ponderado métrica para evaluar las similitudes de las comunidades microbianas al considerar individuo (signalment, prurito asociado con la enfermedad alérgica en la piel, problemas en los oídos, y la presencia de pulgas) y ambiental (tiempo pasado en el interior y el tipo de entorno inmediato) características en los perros sanos. Una agrupación, sobre la base de similitudes de árboles filogenéticos moleculares bacterianas, no se observó entre perros sanos cuando la raza, la edad, el sexo, la presencia de pulgas, los hábitos de vivienda, cubierta y ambientes al aire libre se compararon entre las diferentes muestras. Una gran grado de variabilidad se observó en todas las muestras de los diferentes sitios de la piel de cada perro, y a partir de muestras del mismo sitio a través de todos los perros. La agrupación sólo se observó para las diferentes zonas de la piel a través de todos los perros, con algunos sitios de la mucosa y de las regiones perianales, agrupación independiente de los lugares de la piel con pelo.

Por: Aline Rodrigues Hoffmann mail, Adam P. Patterson, Alison Diesel, Sara D. Lawhon, Hoai Jaclyn Ly, Christine Elkins Stephenson, Joanne Mansell, Jörg M. Steiner, Scot E. Dowd, Thierry Olivry, Jan S. Suchodolski.

CONTINUA...

Copyright © Psicolmascot. Por: Erik Farina (Psicólogo Canino, Especialista en Comportamiento Canino)


Copyright 2014 Psicolmascot. All rights reserved. This material may not be published, broadcast, rewritten or redistributed. - Derechos de autor 2013 Psicolmascot. Todos los derechos reservados. Este material no puede ser publicado, transmitido, reformado o redistribuido.








Copyright © Psicolmascot. Por: Erik Farina (Psicólogo Canino, Especialista en Comportamiento Canino)


Copyright 2014 Psicolmascot. All rights reserved. This material may not be published, broadcast, rewritten or redistributed. - Derechos de autor 2013 Psicolmascot. Todos los derechos reservados. Este material no puede ser publicado, transmitido, reformado o redistribuido.


No hay comentarios:

Publicar un comentario