lunes, 18 de marzo de 2013

Un fósil siberiano revelado como uno de los más antiguos conocidos de los perros domésticos.


El análisis del antiguo ADN afirma que el cánido de Altai como un perro primitivo.

El origen de los perros domésticos sigue siendo polémica, con los datos genéticos que indica una separación entre los perros y los lobos modernos en el Pleistoceno tardío. Sin embargo, sólo unos pocos como perros fósiles se encuentran antes del Último Máximo Glacial, y es ampliamente aceptado que la domesticación del perro es anterior al inicio de la agricultura hace unos 10.000 años.

Con el fin de evaluar la relación genética de una de las más antiguas de los perros, se ha aislado el antiguo ADN de la recientemente descrita de un perro putativo Pleistoceno de 33.000 años de edad, de Altai y se analizaron 413 nucleótidos de la región de control mitocondrial. Nuestro análisis revela que el haplotipo único del perro de Altai está más estrechamente relacionado con los perros modernos y cánidos prehistóricos del Nuevo Mundo de lo que es para los lobos actuales. Otros análisis genéticos de los cánidos antiguos puede revelar una fecha más exacta y el centro de la domesticación.

La domesticación de los perros del lobo gris es bien aceptada. Sin embargo, el momento y el lugar y el número de eventos de domesticación sigue siendo activamente debatido. El registro arqueológico proporciona que el perro sigue siendo inequívoco comenzando hace unos 14.000 años de calendario (CY) y que requieren una domesticación que es anterior a la agricultura.

Los presuntos perros permanece con edades comprendidas entre 31.000 a 36.000 cy, han sido cuestionados como potencialmente representan intentos abortados de domesticación, o lobos morfológicamente únicos. Un análisis completo del genoma mitocondrial de los perros modernos sugiere un origen en el sur de China alrededor de hace 16.000 años, mientras que un amplio nuclear del genoma en todo el análisis de SNP apoya un origen de Oriente Medio y Europa, que está más de acuerdo con los datos arqueológicos .

Aquí hemos aislado, secuenciado y analizado 413 nucleótidos de la región de control del ADN mitocondrial de un espécimen de perro putativo de una fecha como de aproximada. 33.000 cy de las montañas de Altai en Asia Central. Sólo se sabe un espécimen único, el perro de Goyet (36.000 cy) que es anterior al perro Altai y por lo tanto es hasta ahora el segundo espécimen más antiguo conocido asignado morfológicamente al perro doméstico.

Materiales y Métodos

La muestra

El cráneo de un antiguo perro de 33.000 cy, como cánido utilizado en este estudio fue desenterrado en Razboinichya Cave (montañas de Altai del sur de Siberia, Figura 1), en 1975, como se describe anteriormente. La excavación fue autorizado plenamente por las autoridades gubernamentales y llevada a cabo en virtud de subvenciones correspondientes de la Academia Rusa de las Ciencias. En la actualidad, la muestra es parte de la colección del Instituto de Arqueología y Etnografía SB RAS. Dientes y fragmentos mandibulares de esta muestra fueron proporcionadas por el Dr. ND Ovodov, coautor y miembro de este Instituto, que tenía autorización institucional para proporcionar este material.

La extracción del ADN, amplificación y secuenciación

Se extrajo el ADN de un incisivo derecho lateral inferior y un fragmento de hueso mandibular del cánido parecido a un perro. Hemos llevado a cabo dos extracciones independientes del antiguo ADN a lo descrito previamente, con algunas modificaciones. Todas las etapas de extracción seguida de estrictos criterios necesarios para garantizar la autenticidad del antiguo ADN, tales como trabajar en un laboratorio independiente, aislado y con medidas para evitar y detectar la contaminación incluidos los controles negativos (por ejemplo, mezcla de extracción sin ningún material óseo) .

La capa de la superficie del hueso (0.5-1.0 mm) se eliminó con un taladro y el material óseo interior se molió en un mortero hasta obtener un polvo fino. De 1 a 1,5 g del polvo se volvió a suspender en 15 ml de 0,5 M EDTA pH 8,0, 0,5% de N-lauril sarcosil (Sigma-Aldrich, Alemania) y 0,5 mg / ml de proteinasa K. La suspensión se incubó durante 15 min a 55 ° C. Las piezas sin disolver se separaron por centrifugación a 5.000 g durante 5 min.

La primera fracción se eliminó y los elementos sólidos restantes se incubaron de nuevo a 55 º C hasta que todo el material óseo se disolvió. El sobrenadante se concentró mediante Amicon Ultra-15 concentrador (Millipore, Alemania) con un tamaño de exclusión de 5 kDa hasta un volumen de 100-120 l. El producto fue purificado utilizando el QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Alemania) según las instrucciones del fabricante.

El antiguo ADN recién aislado fue amplificado utilizando la amplificación de todo el genoma (WGA) Kit (Sigma-Aldrich, Alemania) como se ha descrito previamente. Hemos aplicado este método para aumentar la cantidad inicial del aDNA con el fin de que esté disponible para posteriores experimentos. Los cebadores para la amplificación de la región de control mitocondrial del antiguo perro se diseñaron basándose en un análisis publicados previamente. Sin embargo, hemos ampliado la longitud de los cebadores con base en la secuencia del ADN mitocondrial de Canis familiaris (perro EU789784) y Canis lupus (lobo FJ978035) a partir de GenBank, por lo que podría aumentar la temperatura de hibridación de la PCR.

Los cebadores se enumeran en la Tabla S1. La localización de los cebadores con respecto a EU789784 secuencia de referencia GenBank se muestra en la Figura S1. La longitud de producto de PCR varió desde 170 hasta 389 pb. Para evitar la amplificación de las citosinas desaminados comunes en el antiguo ADN, se utilizó el Phusion de alta fidelidad de la ADN polimerasa (Thermo Scientific, Finlandia) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para cada PCR se emplearon concentraciones estándar de tampón (fabricante incluido), dNTPs (0,2 mM), cebadores (1 M) y enzima (0,02 U / l). Una l de la ADN (WGA producto) se añadió a la 25 l de la mezcla de reacción.

El protocolo de PCR incluía 35 ciclos de 3 min a 98 ° C, 30 seg a 70 ° C, y 10 seg a 72 ° C. Después de dos rondas de amplificación por PCR, los residuos de PCR se separaron por electroforesis en gel y se separa por escisión de banda. El ADN de la banda que contiene los productos de la PCR se aisló utilizando el Gel Extraction Kit (Qiagen, Alemania). La secuenciación con los mismos cebadores usados ​​para la amplificación se llevó a cabo en el centro Interinstitucional de secuenciación de ADN en SB RAS.

Los análisis de datos

La secuencia se comparó primero a las secuencias públicamente disponibles en la base de datos NCBI nr por medio de búsquedas BLASTN. Con el fin de realizar la asignación de probabilidad, la red, y la reconstrucción filogenética de árboles, incorporamos la secuencia de la muestra de Altai en una alineación de 72 perros (70 razas conocidas), 30 lobos y coyotes (cuatro Tabla S2). Además de los perros y los lobos actuales, que además incluye información de la secuencia de 35 especímenes prehistóricos de cánidos del nuevo mundo.

Se evaluó el modelo de sustitución más adecuado para nuestro conjunto de datos mediante la opción de prueba del modelo implementado en el programa MEGA 5. Hemos aplicado para que sea el mejor modelo o bien apoyado alternativas siempre que sea el modelo más probable en el que no estaba disponible en los programas que se utilizan para la reconstrucción filogenética.

El mapeo de probabilidad, permite la visualización de informatividad filogenético de un alineamiento de secuencia. Utilizando una ponderación de un cuarteto de topología, este método proporciona una poderosa herramienta para evaluar si la secuencia de evolución se produjo de una manera en forma de estrella o el resultado de un árbol completamente resuelto. Además, predefiniendo la secuencia de las agrupaciones, el método puede ser utilizado para evaluar el apoyo de cada una de las posibles topologías en un cuarteto.

En este caso, se realizó un mapa de Probabilidad utilizando TREE-PUZZLE v5.2. Todos los cuartetos posibles se utilizaron cuando pueden inferir en el apoyo de diferentes topologías para los arreglos de ramas diferentes. Sin embargo, al evaluar el conjunto de los datos completo sin particiones, sólo 10.000 cuartetos fueron aplicados. El HKY con cinco categorías de tasa de gamma fue utilizado como un modelo de sustitución.

Figura S 2
El programa de la red v4.610 se utilizó para construir una red filogenético de todos los haplotipos. Una ventaja de esta reconstrucción filogenética es una visualización completa de las relaciones de haplotipos complejos mediante la creación de una red en lugar de un árbol y que incluye los posibles nodos ancestrales o intermedio. Con el fin de reducir la complejidad de la red, los haplotipos idénticos se combinaron y sus respectivas frecuencias se indican con el tamaño de los círculos en la figura S3. 

Hemos ajustado la tasa de transición / transversion dando cinco veces más peso a transversions y enraizado en la red con los coyotes. Se combinaron el algoritmo mediana uniendose con la opción de MP para reducir aún más la complejidad de la red producidas por exclusión de los enlaces superfluos.

Por último, hemos utilizado el genoma mitocondrial completo de todos los perros y los lobos contemporáneos con el fin de mantener grupos estadísticamente bien compatibles de todos los perros y los lobos (véase la figura S4) y se evaluó la posición relativa de la muestra de Altai por medio de la conexión vecina, máxima parsimonia y máxima reconstrucciones de árboles de probabilidad que emplean MEGA 5. Con el fin de evaluar la solidez y el apoyo estadístico de los árboles, que corrió cada análisis filogenético con 1.000 bootstraps pero variaba el árbol de algoritmos de búsqueda, así como los modelos de sustitución. 

Las distancias genéticas se calcularon bajo el supuesto de los parámetros Kimura 2, el modelo de mejor ajuste cuando se aplica una alineación truncada de 413 nucleótidos, y las pruebas de significación estadística mediante la prueba de Mann-Whitney U implementado en un paquete R-software.

Fifura S 3
Resultados y Argumento

Se obtuvieron las secuencias de ADN mitocondrial de la región de control tanto de los dientes y la mandíbula de la muestra de 33.000 cy del antiguo perro putativo de Altai y nos parecieron ser idénticos. Con el fin de evaluar la relación genética de la muestra de Altai a cualquier conocida muestra de perro / lobo, hemos realizado varios análisis. En primer lugar, una búsqueda BLASTN de la secuencia de Altai (413 nucleótidos) contra la base de datos NCBI nr de manifiesto la similitud en el nivel de 99% (puntuación máx. 756), pero no es rival perfecto para cualquier perro o lobo existente. Puesto que la secuencia que se encontró era única, fue depositada en GenBank con el número de acceso JX173682.

En segundo lugar, comparamos nuestra secuencia de tres ya publicadas de 57-nucleótidos fragmentos de ADN mitocondrial del lobo de la misma cueva (cueva Razboinichya, 32.500, 48.000 y 50.000 años sin calibrar,) y se encontró al perro de Altai de ser diferente a los 2, 3 y 3 posiciones de nucleótidos, respectivamente. Esto indica que los lobos anteriormente descritos del pleistoceno de la cueva Razboinichya no están estrechamente relacionados con la muestra estudiada aquí. Sin embargo, más datos de los lobos prehistóricos de la misma región se necesitan para estimar la diversidad de la población y obtener una visión más completa de las relaciones genéticas de los cánidos Altai.

Las Reconstrucciones filogenéticas inequívocas de la historia evolutiva de los perros y los lobos contemporáneos han sido a menudo obstaculizado por eventos de hibridación dentro del género Canis, lo que lleva a los árboles sin resolver o valores bajos de apoyo de los patrones de ramificación cuando se utilizó la información mitocondrial. Al investigar la informatividad filogenética de nuestra base de datos que combina la muestra de Altai, 72 perros existentes, 30 lobos y 35 cánidos prehistóricos del Nuevo Mundo y cuatro coyotes también encontramos poco apoyo ya sea para un patrón claramente resuelto ramificación o de evolución en forma de estrella (Figura S2).

Tabla S 2
El patrón de distribución de los cuartetos de 10.000 investigados (Figura S2A) reveló una probabilidad igual de tres topologías resueltas (23,5%, 23,8% y 23,7% en la Figura S2B) y sólo una probabilidad ligeramente menor para una evolución en forma de estrella en la que los tres topologías tienen la misma probabilidad (21,8%). Este resultado se apoya además en las redes de haplotipos que se manifestaron en forma de estrella en patrones de divergencia (por ejemplo H_1 (incluyendo la muestra de Altai), H_48 o H_2 (Figura S3)).

Strimmer y Haeseler sugieren que el análisis de secuencias más largas puede aumentar la informatividad de la alineación y, en consecuencia, se compara entonces la secuencia de Altai para el genoma mitocondrial completo de 72 perros, 30 lobos y cuatro coyotes como así como las secuencias superpuestas de un total de 35 precolombinos perros y cánidos del Pleistoceno. La opción de la eliminación por pares aplicados en el análisis filogenético nos permitió retener el agrupamiento haplotipo basada en genomas mitocondriales completos de perros contemporáneos (Figura 2, véase también la figura S4, Figura S5), y para colocar el haplotipo Altai con respecto a los subtipos de perros grandes . El vecino a participado en árbol bootstrap de secuencias antiguas y modernas que muestra una separación bien apoyada de todos los perros contemporáneos de coyotes y dos haplotipos de lobo basal (Figura 2).

El haplotipo derivado de los grupos de muestras de Altai entre las secuencias obtenidas a partir de las pre-colombinas de los perros y otros cánidos del Pleistoceno Superior como el lobo. Este grupo de haplotipos se incrusta en un clado que comprende secuencias de perros exclusivamente contemporáneos (Clado A) y contiene la mayoría de los haplotipos del perro incluyendo las razas tan diversas como el mastín tibetano, el Terranova, el Crestado Chino, Cocker Spaniel o Siberian Husky (Tabla S2). Cabe destacar que el apoyo estadístico de los análisis filogenéticos es débil ya que los valores de arranque son bajos (por debajo de 50 valores se omiten pero véase la Figura S5).

Figura S 5
Sin embargo, a pesar de la disposición de los haplotipos individuales cambian cada vez que la aplicación de diferentes métodos de construcción de árboles (máxima verosimilitud, máxima parsimonia, participación del Vecino), la relación cercana y la colocación del Altai haplotipos dentro del perro Clade A eran consecuentes. Esta relación se ve apoyada por los análisis adicionales, tales como una asignación de probabilidad de agrupamiento de cuatro (Figura 3) o la red de haplotipos (Figura S3).

La asignación de la probabilidad revela un fuerte apoyo para una topología de agrupar la muestra de Altai con perros contemporáneos (Figura 3A: 53,9%) a favor de los acuerdos de agrupación de la muestra Altai, ya sea con coyotes o lobos (Figura 3A: 1,6%, 8,4%, respectivamente). Cuando se intercambian los coyotes con cánidos prehistóricos del Nuevo Mundo a partir de las topologías que une la muestra de Altai con perros contemporáneos o cánidos prehistóricos eran casi igualmente probables. Sin embargo, estas asociaciones eran aproximadamente cuatro veces más probable que una disposición de la muestra de Altai con los lobos modernos.

Una inspección más a fondo de la red haplotipo también revela que los haplotipos que tienen la relación más estrecha con la muestra de Altai (incrustados en H_1 en la Figura S3) se componen del perro o prehistoricos cánidos haplotipos del Nuevo Mundo (Figura S3, Tabla S3). Con el fin de evaluar adicionalmente estas relaciones estrechas se analizó la distancia genética pairwise, asumiendo un modelo de sustitución del Parámetro de Kimura 2 (Figura 4) y se encontró que la agrupación haplotipos en Clado A, tenía la menor distancia genética (2-5 diferencias sobre una alineación de 413 nucleótidos ), seguido por las distancias más pequeñas que existen en las segundas diferentes comparaciones de los perros pre-colombinos, y la mayor distancia de las diferencias a los lobos actuales. Además, al comparar las distancias derivadas de todos los haplotipos de los perros para que de todos los lobos, encontramos una distancia significativamente más pequeña genética de la muestra de Altai a los perros modernos (Mann-Whitney U, p <0 font="">

En conclusión, nuestros análisis apoyan la hipótesis de que la muestra de Altai que está más estrechamente relacionada con los perros domésticos que a los lobos existentes, pero hacemos hincapié en el punto de que estos análisis se limita a un solo lugar, de herencia materna y que se necesitaría más datos de la secuencia para obtener una filogenia estadísticamente bien apoyada y sin ambigüedades para resolver la relación genética de la muestra de Altai. Sin embargo, este análisis preliminar confirma la conclusión de que la muestra de Altai que es probable que un perro antiguo con una divergencia superficial de los lobos antiguos. Estos resultados sugieren una historia más antigua del perro que fuera de Oriente Medio o de Asia oriental, como ya se sugirió de los centros del origen del perro. Los descubrimientos adicionales de los antiguos restos como del perro son esenciales para seguir reduciendo el tiempo y la región de origen del perro doméstico.

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias al editor y dos revisores por sus comentarios constructivos que mejoraron el manuscrito. OT agradece a D. Schwochow por sus valiosos comentarios sobre una versión anterior del manuscrito.

Contribuciones de los autores

Concebido y diseñado los experimentos: RKW ASG. Realizó los experimentos: ASD. Analizados los datos: ASD OT. Contribuido reactivos / materiales / herramientas de análisis: NO NVV. Escribió el documento: OT IVA ASD JAL RKW ASG.

Por: Anna S. Druzhkova equal contributor, Olaf Thalmann equal contributor, Vladimir A. Trifonov mail, Jennifer A. Leonard, Nadezhda V. Vorobieva, Nikolai D. Ovodov, Alexander S. Graphodatsky, Robert K. Wayne

Tradu y Publi: Erik Farina, Etólogo Canino, Psicolmascot.


Figura 1. Mapa que muestra el origen geográfico de la muestra del perro de Altai.
Figura 2 : Árbol Consenso de vecinos Participar (1.000 pasos de arranque), construido suponiendo que el modelo de sustitución de Tamura-Nei, el mejor modelo de ajuste para el conjunto de datos que comprende genomas mitocondriales completos de coyotes (Coyotes), lobos (OWW, NWW - lobos del Viejo Mundo y el Nuevo, respectivamente) y perros combinados con secuencias parciales de la región de control de la muestra Altai (perro de Altai) y otros cánidos prehistóricos (perros pre-colombinos, lobos orientales Beringia). Destacamos todos los clados que contienen perros modernos en Clado luz azul y ampliada A para una mejor visibilidad. La posición de la muestra de Altai está marcado con una flecha de luz azul en la ampliación. Bootstrap valores se muestran con un asterisco siempre mayor que 50.

Figura 3. Probabilidad del análisis mapeado de los 142 secuencias cánidos agrupados en cuatro grupos. El panel superior muestra el patrón de distribución de todos los cuartetos y el panel inferior representa la fracción de cada región ocupada. Cuartetos situadas en la parte central del triángulo compatible con una secuencia de la evolución en forma de estrella mientras que los cuartetos en las tres esquinas de apoyo decidido topologías, respectivamente. A) del patrón de asignación de probabilidad cuando la agrupación de las secuencias del perro de Altai, perros, lobos y coyotes. B) el patrón de asignación de la probabilidad cuando las secuencias se agruparon de la siguiente manera: Perro de Altai, los perros, los lobos y cánidos prehistóricos del Nuevo Mundo.


Figura 4. Diagrama de caja que muestra las diferencias genéticas entre la muestra de Altai y varias agrupaciones de cánidos actuales y extintos. Las distancias genéticas se calcularon bajo el supuesto modelo de sustitución de parámetros de Kimura 2, el mejor ajuste para la alineación truncado de los cánidos. La caja resaltada muestra las diferencias mínimas y máximas contadas. 1 Leonard et al. 2007, 2 Leonard et al. 2002.

Figura S1. El esquema de secuenciación del perro de Altai superpone a la secuencia de ADN mitocondrial canino de GenBank (EU789784). Las líneas verticales discontinuas indican los límites de 413 pb de secuencia utilizado en este trabajo. Las flechas pequeñas indican las posiciones de todos los cebadores de la Tabla S1. Bares 1-6 indican reacciones de PCR independientes con diferentes combinaciones de cebadores: (1) - D1F/D1R (365 pb), (2) - D2F/D09R (389 pb), (3) - D1F/D2R (343 pb); (4) - D10F/D09R (195 pb), (5) - D3F/D3R (212 pb), (6) - D5F/D09R (170 pb).

Figura S2. Probabilidad del análisis de mapeo de todos los cánidos 142 sin compartimentación adicional de los datos. El panel superior muestra el patrón de la distribución de todos los cuartetos y el panel inferior representa la fracción de cada región ocupada.

Figura S3. Red Haplotipo que resumen las relaciones filogenéticas de los haplotipos únicos. Haplotipos idénticos que se colapsó y los tamaños de los círculos indican las frecuencias. Haplotipos diferentes están etiquetados con H_XX (círculos amarillos) y la hipótesis de los vectores de la mediana con mvXX (círculos rojos). La longitud de los enlaces entre los nodos es proporcional a las diferencias mutacionales. Para una mejor visibilidad, el enlace a la raíz (coyotes) y dos anómalos haplotipos lobo se truncan y el grupo de haplotipos que contiene el perro Altai está resaltado en verde.

Figura S4. Árbol de los vecinos que Participan generado con los genomas mitocondriales de 72 perros y los 30 lobos con 1.000 pasos de arranque. Las áreas sombreadas indican los cuatro grupos bien apoyados del perro y el punto de flechas a los valores de soporte para cada clado.

Figura S5. Los Vecinos que Participan en el árbol que representa una versión totalmente anotada del árbol que se muestra en la Figura 2 generado con 413 pb de la región hipervariable del genoma mitocondrial. Los valores en rojo indican el apoyo de arranque después de 1.000 pasos. Los identificadores se explica en la Tabla S2 con la excepción de las secuencias etiquetadas "JAL". La nomenclatura se adopta este último de Leonard et al. 2007 [24] y Leonard et al. 2002 [23] y las flechas apuntan a los valores de soporte para cada clado.

Tabla S1. Lista de los cebadores utilizados en este estudio.

Tabla S2. Nomenclatura, número de acceso y raza / origen geográfico de los distintos haplotipos del perro / lobo.


Tabla S3. Asignaciones de haplotipos para el análisis de redes.


Tradu y Publi: Erik Farina, Etólogo Canino, Psicolmascot.

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