Un nuevo estudio del Cáncer de Hueso de los Perros.

 

Un nuevo estudio del Cáncer de Hueso de los Perros.

El paisaje genómico de las líneas celulares de osteosarcoma canino revela una complejidad estructural conservada y alteraciones de las vías.

Introducción.

Las líneas celulares establecidas se utilizan comúnmente en la investigación preclínica del cáncer para ayudar a diseccionar muchas facetas de la biología del tumor, incluyendo la sensibilidad a las nuevas terapias y el papel de las aberraciones moleculares y genéticas en la progresión de la enfermedad.

La última década ha sido testigo de un crecimiento y una utilización sin precedentes de los datos genómicos tumorales para guiar los enfoques terapéuticos, de diagnóstico y de pronóstico. Por lo tanto, la incorporación continua y precisa de datos in vitro en la investigación del cáncer requiere una comprensión completa del panorama genómico de estas herramientas.

Esto es especialmente relevante en la evaluación preclínica de terapias dirigidas, que dependen del conocimiento del espectro de alteraciones genéticas en las células cancerosas. Por ello, la secuenciación del genoma completo y del exoma de las líneas celulares (WGS y WES, respectivamente) se evalúa cada vez más al mismo tiempo que las muestras de tumores primarios.

Aunque se ha realizado una amplia documentación de las líneas celulares tumorales humanas y murinas, las líneas celulares tumorales caninas han sido objeto de un análisis genómico relativamente limitado. Dado que los perros con cáncer espontáneo se utilizan cada vez más para evaluar nuevas terapias en el entorno preclínico, es importante que las herramientas de acompañamiento utilizadas para los estudios in vitro se definan a fondo, en particular con respecto al paisaje genómico.

Por ejemplo, en los estudios preclínicos se emplean diversas líneas celulares de osteosarcoma (OS) canino; sin embargo, se han caracterizado principalmente utilizando métodos que definen un espectro relativamente estrecho de alteraciones moleculares y de vías.

Se ha evaluado un número limitado de líneas de osteosarcoma mediante RNA-seq y WES, demostrando firmas transcripcionales conservadas y mutaciones puntuales en TP53 con tumores secuenciados.

Nosotros y otros hemos caracterizado recientemente el osteosarcoma primario canino utilizando WGS, WES y secuenciación de ARN, demostrando una significativa complejidad estructural, incluyendo aberraciones en SETD2, DMD, DLG2 y MYC, entre otras.

Varias de ellas no se observaron en el examen previo de las líneas celulares de osteosarcoma canino, en gran parte debido a que una característica definitoria del OS canino es la presencia de grandes cambios estructurales que son más difíciles de detectar mediante WES. Por lo tanto, realizamos WGS en ocho líneas celulares de osteosarcoma canino para caracterizar el paisaje del genoma del tumor y evaluar las similitudes y diferencias entre estas líneas celulares y los tumores primarios de OS canino que se producen naturalmente.

Materiales y métodos.

Adquisición de líneas celulares y extracción de ADN

Las líneas celulares OSCA2 y OSCA8 (por ejemplo, OSA2 y OSA8) fueron un generoso regalo del Dr. Jamie Modiano (Universidad de Minnesota). Las líneas celulares Abrams y Gracie fueron proporcionadas por el Dr. Douglas Thamm (Universidad Estatal de Colorado).

El ADN genómico extraído de las líneas celulares HMPOS, McKinley (por ejemplo, MacKinley), Moresco (por ejemplo, Marisco) y OS2.4 fue proporcionado por el Dr. Douglas Thamm (Universidad Estatal de Colorado). Las cuatro líneas celulares restantes (OSCA2, OSCA8, Abrams, Gracie) fueron confirmadas como negativas al micoplasma mediante PCR antes del aislamiento del ADN.

El ADN se aisló utilizando el DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen Inc., Hilden, Alemania). Se llevó a cabo una validación adicional de la línea celular mediante el perfil de repeticiones cortas en tándem (STR) en el ADNg extraído utilizado para la WGS con loci disponibles comercialmente (kit de genotipado canino Stockmarks, Applied Biosystems) según las recomendaciones del fabricante y se comparó con los loci disponibles publicados para cada línea celular cuando estaban disponibles.

Construcción de bibliotecas y secuenciación.

La WGS fue realizada por la Plataforma Genómica del Instituto Broad en una plataforma Illumina con seguimiento de la muestra con LIMS automatizado como se describió previamente. Brevemente, 100 ng de ADN genómico fueron sometidos a un cizallamiento utilizando un sonicador ultrafocalizado Covaris, seguido de una limpieza con perlas SPRI.

Se utilizó el KAPA Hyper Prep Kit con Library Amplification Primer Mix (KAPA Biosystems; #KK8504) con adaptadores palindrómicos en horquilla que contenían una secuencia de índice única de 8 bases (Roche). Tras la normalización de las bibliotecas a 2,2 nM, se completó la amplificación de grupos y la secuenciación en un HiSeqX, utilizando los kits de secuenciación por síntesis para generar lecturas de 151 pb de extremo emparejado. Las muestras se secuenciaron a una profundidad objetivo de 30x.

Preprocesamiento de los datos de secuenciación.

Las muestras alcanzaron una profundidad de secuenciación media de 53,7x (rango 38,5x - 80,9x, Tabla S1). Los datos de secuenciación de la línea celular se procesaron mediante el flujo de trabajo ilustrado en la Fig. 1. Brevemente, los archivos fastq se alinearon con el genoma de referencia canino (CanFam3.1) utilizando BWA y posteriormente se sometieron a un control de calidad siguiendo las mejores prácticas de GATK.

Para todas las herramientas de GATK, se utilizó la versión 4.1.3.0, a menos que se indique lo contrario. Las lecturas duplicadas se identificaron utilizando Picard Tools MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard). La recalibración de la puntuación de calidad de las bases (BQSR) se realizó utilizando un archivo VCF que contenía variantes de la línea germinal identificadas en 676 perros y otros cánidos.

Determinación de mutaciones somáticas simples.

Las mutaciones somáticas simples (variantes de un solo nucleótido (SNV) y pequeñas inserciones/deleciones (indels)) se detectaron utilizando un enfoque de llamada de consenso que combina Mutect2 y Platypus, los cuales permiten la llamada de variantes sin una muestra normal emparejada.

Mutect2 se ejecutó utilizando los scripts WDL de GATK Showcase disponibles en la plataforma de computación en la nube Terra. En primer lugar, se generó un panel de variantes normales utilizando datos WGS de la línea germinal de 23 perros de un conjunto de datos previamente publicado.

El VCF de las variantes de la línea germinal llamadas en 676 perros y otros cánidos se utilizó como referencia de la línea germinal, y un subconjunto de estas variantes se utilizó en el paso CalculateContamination.

Mutect2 se ejecutó con los argumentos adicionales "-downsampling-stride 20-max-reads-per-alignment-start 6-max-suspicious-reads-per-alignment-start 6". FilterMutectCalls se ejecutó con la opción "-run_orientation_bias_mixture_model_filter" ajustada a "True" y la opción "-min-median-read-position" ajustada a 10 pb.

Los cromosomas no anclados y mitocondriales se excluyeron de la llamada de variantes. Las variantes también se llamaron en las líneas celulares y en 23 BAMs WGS normales publicados utilizando Platypus (v. 0.8.1), con la bandera "-minReads" establecida en 3.

Empleamos un proceso de filtrado de varios pasos para identificar las llamadas de variantes de alta confianza y eliminar las variantes putativas de la línea germinal en la medida de lo posible. Como nuestro VCF de referencia de la línea germinal se había actualizado para eliminar dos individuos y todas las variantes no admitidas por los 674 individuos restantes, actualizamos el indicador de filtro en las llamadas de Mutect2 para reflejar estos cambios.

Paso 1: utilizando Bcftools (v. 1.12) se reajustó el indicador de filtro a "PASS" para cualquier variante en la salida de Mutect2 que se superpusiera a la posición de una variante eliminada de la referencia de la línea germinal y en la que el campo de filtro se estableciera como "línea germinal" solamente.

Paso 2: se utilizó el mismo enfoque para restablecer la bandera "alleleBias" en la salida de Platypus, ya que esto podría eliminar las variantes somáticas de baja fracción alélica. Paso 3: se creó un panel de normales para los datos de Platypus fusionando las llamadas de variantes de las mismas muestras de la línea germinal utilizadas en el panel Mutect2.

A continuación, se utilizó el comando isec de Bcftools para eliminar las llamadas de variantes en los datos de la línea celular de Platypus que se solapaban con la posición de una variante llamada en el panel de normales.

Paso 4: se eliminaron los sitios con una bandera de filtro no pasante utilizando Bcftools view. Paso 5: Bcftools isec se utilizó para mantener sólo las variantes llamadas tanto en Mutect2 como en Platypus para cada línea celular. Paso 6: Bcftools isec se utilizó para eliminar las variantes putativas de la línea germinal vistas en el VCF de referencia de la línea germinal, en el conjunto de SNPs de la línea germinal de Broad, o en el conjunto de SNPs de la línea germinal de Axelsson.

Paso 7: se utilizó la vista de Bcftools para eliminar las llamadas de variantes con una fracción alélica (AF) < 0,05, profundidad de lectura (DP) < 10, o menos de 3 lecturas que apoyaran el alelo alternativo. Paso 8: los sitios somáticos putativos restantes fueron regenotipados en 23 muestras normales de la línea germinal utilizando la herramienta Graphtyper, y las variantes encontradas en las muestras de la línea germinal fueron filtradas utilizando Bcftools.

Las variantes pasantes se anotaron utilizando SnpEff v5.0e. El paquete KaryoploteR, usando R (R3.5.0) fue implementado para identificar áreas de kataegis [35]. Se crearon gráficos de mutaciones con la herramienta lollipops. Los genes con mutaciones recurrentes fueron priorizados por su probable relevancia en el OS canino como se describió previamente.

Llamada de razas.

Los archivos BAM preprocesados se genotiparon en ubicaciones de variantes putativas de la línea germinal utilizando GATK HaplotypeCaller (versión 4.1.0.0) con el modo de ajuste de genotipado GENOTYPE_GIVEN_ALLELES. Se utilizó una versión anterior de nuestra referencia de línea germinal como lista de sitios a genotipar.

Esta referencia de línea germinal contenía 435 muestras (287 perros de raza pura, 6 perros con ascendencia desconocida, 100 perros indígenas o de pueblo de todo el mundo, 36 lobos y otros 6 cánidos salvajes). Para determinar la raza de cada línea celular, se creó el pipeline de llamada de raza seleccionando datos de genotipos disponibles públicamente (N = 1.212) [25, 26, 37] de 101 razas modernas con al menos 12 perros de raza pura por raza.

Se calculó la estadística F de Wright mediante el método de Hudson para cada raza utilizando 2.468.442 polimorfismos de nucleótido único bialélicos con <10% de genotipos perdidos. Se seleccionaron los SNPs con FST>0,15 en todas las comparaciones y se realizó una poda basada en LD en ventanas de 50kb (r2>0,5) para extraer 688.060 marcadores para la inferencia de la ascendencia global. Se fusionaron los genotipos de estos SNPs de las líneas celulares con los genotipos de las muestras de referencia, y luego se realizó la inferencia de ascendencia global utilizando ADMIXTURE [38] en modo supervisado (semilla aleatoria: 43).

Llamada a la firma mutacional.

Se utilizó la herramienta SigProfilerMatrixGenerator [39] para generar una matriz de contextos mutacionales variantes. A continuación, se utilizó la herramienta SigFit (v2.2) para identificar las firmas de sustitución de base única (SBS) de COSMIC v3 [41] presentes en los datos de la línea celular.

La matriz de oportunidades mutacionales para el genoma CanFam3.1 fue amablemente proporcionada por Adrián Báez-Ortega, de la Universidad de Cambridge, uno de los autores de SigFit. El ajuste se realizó con 10.000 iteraciones y 5.000 iteraciones de calentamiento, utilizando el modelo multinomial. Se seleccionaron las firmas que eran suficientemente mayores que cero (lo que significa que el extremo inferior del intervalo Bayesiano HPD era > 0,025 en cualquier muestra) y se volvió a realizar el ajuste utilizando sólo esas firmas.

Llamada de variantes estructurales.

Las aberraciones somáticas del número de copias (SCNAs) se detectaron utilizando el pipeline GATK somatic CNV, a través del espacio de trabajo Terra showcase WDLs. Se creó un panel autosómico de normales utilizando las 23 muestras de la línea germinal, y se crearon paneles sólo de hombres y sólo de mujeres para el cromosoma X. La opción "do_explicit_gc_correction" se estableció en "True" para la creación del panel. Como el sexo del donante no estaba anotado para muchas de las líneas celulares, determinamos el sexo basándonos en la relación de la profundidad media de las lecturas en los autosomas y en el cromosoma X (determinada por la herramienta GATK DepthOfCoverage).

Los ratios de cobertura X/autosoma entre 0,3 y 0,7 se consideraron masculinos, y los ratios entre 0,8 y 1,2 se consideraron femeninos. Se realizó la llamada de CNV, con los parámetros de suavización "kernel_variance_allele_fraction" y "kernel_variance_copy_ratio" establecidos en 0,8, y "num_changepoints_penalty_factor" establecido en 5. Los gráficos de CNV se rehicieron utilizando un archivo DICT ordenado para trazar los cromosomas en orden numérico y excluir los cromosomas no anclados y mitocondriales.

Las pérdidas de número de copias con un cambio de pliegue log2 de ≥ 0,4 (ganancia de una copia) o ≤ -0,9 (pérdida de dos copias) se consideraron en nuestro análisis. Se utilizó un script personalizado de Python para anotar el solapamiento de los segmentos de número de copias con los genes utilizando la anotación de genes caninos de Ensembl (Release 99).

Las variantes estructurales (SV) se llamaron utilizando la versión 1.6.0 de Manta. Las líneas celulares y las 23 muestras normales de la línea germinal se ejecutaron por separado utilizando la configuración de sólo tumor o línea germinal, según el caso. Los VCFs de salida se procesaron utilizando el script "convertInversion.py" proporcionado por Manta para convertir las inversiones al antiguo formato INV, en lugar del formato actual de final de ruptura (BND). Para mitigar la incidencia de falsos positivos cuando se analizan muestras derivadas de tumores no coincidentes, se realizaron múltiples pasos de filtrado.

Paso 1: se creó un panel de normales fusionando las llamadas SV de los 23 VCFs de la línea germinal con cada uno de los VCFs de la línea celular utilizando la herramienta Jasmine [45], usando los ajustes "-nonlinear_dist max_dist = 1000", "-output_genotypes", y "-keep_var_ids". Se utilizó un script personalizado de Python para añadir genotipos al campo "GT" de manera que los VCFs pudieran ser analizados por Bcftools.

Todos los genotipos se fijaron en 0/1. Para cada línea celular-panel de normales fusionado VCF, se extrajeron los IDs de variantes presentes en la línea celular pero en ninguna de las normales. Paso 3: utilizando Bcftools, se eliminaron los IDs de variantes presentes en las normales, así como las variantes en las que el campo de filtro no era "PASS", que estaban marcadas como "IMPRECISO", o en las que ni el soporte de lecturas emparejadas (PR) ni el de lecturas divididas (SR) era mayor o igual a 15. Se utilizó la herramienta "vcfbedsetfilter" de Jvarkit para marcar las variantes que se solapaban con las regiones centroméricas putativas (ventanas de 5000 pb que contienen ≥80% de repeticiones centroméricas, de https://github.com/Chao912/Mischka/CanFam3.1.centromere.bed).

Paso 4: las variantes restantes no filtradas se volvieron a genotipar en las muestras normales utilizando la herramienta Graphtyper, y cualquier variante con soporte en una muestra normal se eliminó utilizando Bcftools. Paso 5: los extremos de ruptura de translocación en los que se había filtrado un extremo en un paso anterior se eliminaron utilizando Bcftools.

  

Comparación con la literatura.

Identificamos cinco conjuntos de datos WES o WGS publicados de tejido canino OS (Sakthikumar, et al. [16], Gardner, et al. [18], Das, et al. [17], Chu, et al. [19]) o líneas celulares (Das, et al. [1]). Las llamadas de variantes se obtuvieron en formato VCF o tabular a partir de los datos suplementarios y se estandarizaron en formato VCF. Para minimizar la variabilidad debida a la anotación de genes y a la estrategia de secuenciación, limitamos nuestra comparación a las regiones codificantes (específicamente, las regiones CDS en la anotación canina Ensembl Release 99) utilizando la vista Bcftools, y reanotamos los VCF de cada estudio utilizando Snpeff.

Se excluyeron las variantes anotadas como de bajo impacto. Las variantes estructurales, incluidas las variantes de número de copias de Gardner, et al. y Chu, et al., se convirtieron de formato tabular a archivos bed. Las regiones superpuestas dentro de cada muestra se fusionaron utilizando Bedtools merge. Los segmentos de número de copias que se encontraron significativamente alterados de forma recurrente en Sakthikumar, et al. también se convirtieron a formato de cama para su comparación, pero no se pudo realizar un recuento de VNC a nivel de muestra.

Los genes solapados por una variante estructural se anotaron utilizando Bedtools annotate para contar el número de solapamientos de las regiones CDS en la anotación canina de Ensembl dentro de cada conjunto de datos. Debido a la falta de información sobre las coordenadas de los extremos de los puntos de rotura para las translocaciones en la literatura, no se pudo realizar una estandarización, y las translocaciones se compararon contando el número de veces que un gen determinado fue anotado como afectado en cada conjunto de datos.

Resultados.

Validación de la línea celular.

Se extrajo el ADN aislado de cada línea celular y se confirmó que era de origen canino y la línea celular de origen declarada mediante interrogación multiplataforma. El perfil de STR y la PCR específica de la especie confirmaron que el ADN secuenciado era canino, y los loci de STR eran coherentes con los comunicados anteriormente.

Además, la llamada de raza y la cobertura de secuenciación sobre el cromosoma X confirmaron el origen de la raza y el sexo de las líneas celulares tumorales cuando se disponía de datos previamente publicados, e identificaron esta información para varias líneas en las que dicha información no estaba disponible públicamente.

Es importante destacar que los perros de la aldea no tienen ascendencia de raza, lo que hace que el algoritmo de llamada de razas llame a muchas razas diferentes, cada una de las cuales se reporta como contribuyente de una pequeña fracción. Esto es especialmente importante para los conjuntos de datos de WGS en los que no se dispone de una muestra de referencia de ADN de la línea germinal, ya que las bases de datos existentes de variación de la línea germinal pueden no capturar con precisión el espectro de variantes normales de la línea germinal en estos perros, lo que da lugar a la aparición falsa de una mayor carga de mutaciones.

Por último, las llamadas de variantes de un solo nucleótido (SNV) entre las diferentes líneas celulares no fueron concordantes, lo que concuerda con la correcta identificación de las líneas celulares y la ausencia de contaminación cruzada entre ellas.

Variantes de un solo nucleótido en las líneas celulares del OS canino.

Las mutaciones sin sentido fueron las SNV codificantes más comunes identificadas en las líneas celulares del OS canino, con una fracción menor de mutaciones de cambio de marco y otros eventos disruptivos. No es sorprendente que se identificara una alta incidencia de variantes no codificantes, incluyendo variantes en la región de empalme y variantes en la región no traducida 3' y 5'.

Es probable que la falta de una referencia de línea germinal emparejada condujera a una mayor incidencia de llamadas falsas positivas en el genoma no codificante. Sin embargo, se reconoce cada vez más que las variantes en las regiones reguladoras contribuyen a la tumorigénesis. Aunque se desconoce la importancia de estas variantes, se justifica una mayor interrogación de las mutaciones no codificantes que pueden afectar a los genes impulsores del cáncer para empezar a atribuir importancia funcional a los elementos no codificantes en el SO.

A pesar de un filtrado exhaustivo, la carga mutacional en cada línea celular, calculada en 5,8 mut/Mb (rango 2,1-14,7, Tabla S5) fue mayor que la reportada previamente en tejidos primarios de OS caninos y humanos [18, 49]. Es probable que esto sea el resultado de un pasaje a largo plazo de las líneas celulares y de la falta de una muestra de referencia de línea germinal del individuo en el que se originó el tumor.

En las líneas celulares Gracie y OSCA-8 se identificaron regiones de hipermutación focal sugestivas de kaetegis. La línea celular HMPOS, que se originó en un perro de pueblo cuya ascendencia no está bien representada en nuestro panel de referencia, tuvo la mayor carga mutacional aparente.

En consonancia con las muestras de tejido primario del OS, las SNV codificantes más comunes fueron las mutaciones en TP53 (7/8; 88%), predominantemente compuestas por mutaciones de sentido erróneo con una menor incidencia de mutaciones de cambio de marco. El único otro gen con SNV codificantes identificado en al menos tres líneas celulares fue DST, un gen que codifica la distonina, una proteína de enlace del citoesqueleto.

Todos los demás SNV codificantes recurrentes eran privados de una o dos líneas celulares. Sin embargo, el espectro de SNVs observado era en gran medida representativo del identificado en las muestras de tejido primario del OS canino, con mutaciones implicadas en la reparación del ADN y el ciclo celular, genes reguladores epigenéticos y de la cromatina, y las vías de señalización PI3K y MAPK.

Comparamos nuestras llamadas de mutaciones somáticas simples con las reportadas previamente en muestras de tejido de OS canino WES/WGS. De los 3.836 genes con SNVs/INDELs notificados en al menos un tumor de OS en estos estudios, 272 (7%) también estaban mutados en al menos una línea celular. TP53 fue el más comúnmente mutado, tanto en la literatura (64%) como en nuestros datos (88%).

De los genes notificados en al menos el 5% de las muestras de OS, FSIP2 (13% de líneas celulares, 11% notificado en la literatura), TTN (3% de líneas celulares, 9% notificado en la literatura), ENSCAFG00000000632 (13% de líneas celulares, 7% notificado en la literatura), RYR2 (13% de líneas celulares, 5% reportado en la literatura), UNC80 (13% líneas celulares, 5% reportado en la literatura), LRP1B (13% líneas celulares, 5% reportado en la literatura), y XIRP2 (13% líneas celulares, 5% reportado en la literatura) fueron mutados en al menos una línea celular.

  

Varios genes comúnmente reportados como mutados en muestras de OS no tenían mutaciones somáticas simples en ninguna de las líneas celulares, más notablemente SETD2 (19% reportado en la literatura), así como NEB (12% reportado en la literatura).

También examinamos la concordancia de nuestras llamadas SNV e INDEL WGS con las reportadas previamente a partir de la secuenciación WES de las mismas líneas celulares. En general, una media del 49% de las variantes codificantes reportadas en WES de estas líneas celulares fueron confirmadas por WGS (rango 35% (McKinley)- 73% (OS2.4)).

Se evaluó el contexto trinucleotídico de los SNV, identificando la exposición a las firmas de sustitución de base única (SBS) de COSMIC v3 en las llamadas de SNV de las líneas celulares.

Las firmas SBS1 (la "firma del envejecimiento", asociada a la desaminación espontánea de la 5-metil-citosina), SBS5 (una firma "tipo reloj" de etiología desconocida), SBS8 (etiología desconocida), SBS9 (posiblemente debida a la hipermutación somática a través de la polimerasa eta en las células linfoides), SBS17a (etiología desconocida), SBS17b (asociada en algunos casos humanos a la quimioterapia con fluorouracilo y al daño por especies reactivas del oxígeno), SBS19 (etiología desconocida), SBS22 (exposición al ácido aristolóquico), SBS30 (deficiencia en la reparación de la escisión de bases, asociada a la pérdida de la función de NTHL1), SBS32 (asociada al tratamiento con azotiaprina), SBS35 (asociada a la quimioterapia con platino), SBS36 (deficiencia en la reparación de la escisión de bases, asociada a la pérdida de la función de MUTYH), SBS37 (etiología desconocida), SBS39 (etiología desconocida) y SBS40 (etiología desconocida, asociada al envejecimiento en algunos cánceres humanos) se identificaron en proporciones variables en las líneas celulares [41]. Las mayores contribuciones fueron las firmas SBS1, SBS40 y SBS5.

Las firmas SBS1, SBS5, SBS8, SBS17a, SBS17b, SBS30, y SBS40 han sido previamente reportadas en muestras de OS humano, mientras que las firmas SBS1, SBS8, SBS9, y SBS17b han sido reportadas en OS canino.

  

Variantes estructurales en las líneas celulares del OS canino.

Se identificaron VS, incluyendo deleciones, inserciones, inversiones, translocaciones y duplicaciones. La incidencia media de VS en este panel de líneas celulares fue de 1139 VS por línea celular, lo cual es notablemente más alto que lo reportado en los tejidos del OS y probablemente sea el resultado de la falta de una muestra de línea germinal compatible disponible. Los SV más comunes fueron deleciones y translocaciones cromosómicas complejas.

En consonancia con las VS reportadas en los tejidos primarios del OS, estaban presentes variantes estructurales sin número de copias que involucraban a DMD (4/8 (50%) líneas celulares), DLG2 (5/8 (62,5%) en este estudio), CDKN2A (6/8 (75%)), MAGI2 (7/8 (88%)), y MLLT3 (6/8 (75%)). En particular, se identificaron múltiples variantes que afectan a los genes epigenéticos y reguladores de la cromatina en todas las líneas celulares, lo que apoya las afirmaciones anteriores que implican alteraciones del paisaje epigenético en la biología del OS.

En 2/8 (25%) de las líneas celulares de este estudio se encontraron deleciones a gran escala que abarcan SETD2, mientras que otra línea celular tenía una duplicación que implicaba a SETD2. Por último, se identificaron SV recurrentes adicionales en NF1 (8/8 (100%)), NEDD4L, una ubiquitina ligasa E3 responsable de la homeostasis de PTEN (7/8 (88%)), así como en los genes de la desmetilasa de histonas KDM4A y KDM4C (alteración en uno de los dos presentes en todas las líneas celulares de este estudio), y KDM5A y KDM5C, (alteración en uno de los dos presentes en todas las líneas celulares de este estudio).

Variantes estructurales en las líneas celulares del OS canino.

Se identificaron VS, incluyendo deleciones, inserciones, inversiones, translocaciones y duplicaciones. La incidencia media de VS en este panel de líneas celulares fue de 1139 VS por línea celular, lo cual es notablemente más alto que lo reportado en los tejidos del OS y probablemente sea el resultado de la falta de una muestra de línea germinal compatible disponible. Los SV más comunes fueron deleciones y translocaciones cromosómicas complejas.

En consonancia con las VS reportadas en los tejidos primarios del OS, estaban presentes variantes estructurales sin número de copias que involucraban a DMD (4/8 (50%) líneas celulares), DLG2 (5/8 (62,5%) en este estudio), CDKN2A (6/8 (75%)), MAGI2 (7/8 (88%)), y MLLT3 (6/8 (75%)). En particular, se identificaron múltiples variantes que afectan a los genes epigenéticos y reguladores de la cromatina en todas las líneas celulares, lo que apoya las afirmaciones anteriores que implican alteraciones del paisaje epigenético en la biología del OS.

En 2/8 (25%) de las líneas celulares de este estudio se encontraron deleciones a gran escala que abarcan SETD2, mientras que otra línea celular tenía una duplicación que implicaba a SETD2. Por último, se identificaron SV recurrentes adicionales en NF1 (8/8 (100%)), NEDD4L, una ubiquitina ligasa E3 responsable de la homeostasis de PTEN (7/8 (88%)), así como en los genes de la desmetilasa de histonas KDM4A y KDM4C (alteración en uno de los dos presentes en todas las líneas celulares de este estudio), y KDM5A y KDM5C, (alteración en uno de los dos presentes en todas las líneas celulares de este estudio).

Del mismo modo, se identificaron diversas mutaciones y aberraciones del número de copias en los genes de la vía PI3K y MAPK, y todas las líneas celulares presentaban al menos una alteración en MAP2K1, MAP2K2, MAP2K4 o MAP2K5. En consonancia con la noción de que el OS es genómicamente heterogéneo, pocas aberraciones en genes individuales fueron recurrentes. Además, se identificaron pérdidas de número de copias, deleciones, inversiones y translocaciones en PTEN (5/8 (62,5%) líneas celulares) y NEDD4L (7/8 (88%)), lo que sugiere que la desregulación de la vía PI3K mediada por PTEN debe considerarse en el contexto de mutaciones concurrentes en NEDD4L, una ubiquitina ligasa E3 que regula negativamente a PTEN.

Discusión.

Las líneas celulares establecidas se han utilizado durante mucho tiempo para estudiar la biología del tumor y la respuesta a las terapias dirigidas. Más recientemente, la evaluación de un solo gen y la WES se han utilizado para trazar el paisaje mutacional de las líneas celulares de cáncer canino, proporcionando un recurso crucial para los estudios prospectivos.

Los datos de la WGS aquí reportados identificaron muchas mutaciones somáticas simples previamente publicadas en conjuntos de datos de WES. Sin embargo, el uso de la WGS permitió interrogar a las CNVs y a las SVs, permitiendo una comprensión más completa del espectro de la desregulación de las vías en las células del OS canino. Esto es particularmente importante en los cánceres genómicamente complejos, como el OS, donde las SNVs de punto caliente son menos comunes.

Mientras que muchas de las mutaciones somáticas simples conocidas asociadas al OS canino se conservaron entre las líneas celulares evaluadas en este estudio, algunas mutaciones típicamente encontradas en los tejidos primarios del OS estaban ausentes. Una característica sorprendente fue la ausencia de mutaciones somáticas simples en SETD2 en las líneas celulares utilizadas en este estudio. Sin embargo, SETD2 se eliminó en dos líneas celulares, y había mutaciones en las desmetilasas de lisina H3K36, lo que sugiere que los mecanismos que impulsan la desregulación de H3K36 son una característica fundamental del OS canino.

La concordancia con las llamadas SNV/INDEL entre las mismas líneas celulares incluidas en nuestro análisis y el análisis WES de Das, et al. fue moderada, y las discrepancias observadas se debieron probablemente a varios factores. Se sabe que los diferentes métodos de secuenciación y llamada de variantes tienen una baja concordancia. Además, el uso de distintos umbrales de filtrado de variantes y de diferentes bases de datos de la línea germinal probablemente dio lugar a la eliminación de conjuntos divergentes de mutaciones. Por otra parte, las presiones selectivas del cultivo in vitro y la inestabilidad genómica actual suelen impulsar el desarrollo de una importante heterogeneidad genética entre diferentes cepas de la misma línea celular

Se identificó una mayor carga mutacional en las líneas celulares del OS en comparación con los tejidos del OS. En parte, esto representa probablemente un error de tipo I debido a la falta de una muestra de línea germinal compatible. Esto es especialmente relevante en la línea celular HMPOS, que se determinó que procedía de un perro de pueblo basándose en nuestro algoritmo de llamada de raza y tiene una variedad de polimorfismos de un solo nucleótido no catalogados en nuestros archivos de recursos de variantes de línea germinal. Como la mayoría de las variantes genéticas son raras, y los perros de pueblo son más diversos genómicamente que los perros de raza pura, la falta de un normal emparejado probablemente dio lugar al mayor número de llamadas de variantes somáticas falsas positivas en la línea HMPOS.

La incorporación de un control de línea germinal emparejado se utiliza habitualmente para minimizar las llamadas de mutaciones falsas positivas en los conjuntos de datos de WES y WGS. Desarrollamos una línea de filtrado estricta tanto para las variantes somáticas simples como para las estructurales con el fin de reducir la aparición de falsos positivos debidos a la falta de una muestra de línea germinal emparejada. Los fundamentos de esta canalización son métodos establecidos en el campo; sin embargo, se aplicó de forma más estricta en este contexto. Por ejemplo, eliminamos cualquier variante que se superpusiera a una variante en nuestro recurso de línea germinal en lugar de exigir que se viera en dos o más individuos.

No exigimos que los alelos alternativos coincidieran, ya que encontramos casos en los que los alelos fueron anotados de forma diferente por distintas herramientas, a pesar de parecer la misma variante. Además, añadimos un paso de regenotipado con la herramienta GraphTyper, que identificó cualquier soporte para variantes somáticas putativas en nuestro panel de normales. Este paso fue especialmente útil para filtrar los INDELs en los que diferentes herramientas podrían situar las posiciones de inicio y final en lugares alternativos.

Creemos que este paso puede explicar algunas de las discrepancias en las llamadas somáticas simples reportadas en nuestro estudio y el estudio de Das, et al. para las mismas líneas celulares. No obstante, debido a las dificultades mencionadas y a la falta de validación ortogonal de nuestras llamadas de variantes, recomendamos que los investigadores validen las variantes de interés con una fracción alélica baja antes de realizar análisis posteriores adicionales.

En general, nuestros datos demuestran que el caótico paisaje genómico de las líneas celulares del OS canino coincide con el observado en el tejido tumoral primario del OS canino, definido por una alta complejidad estructural y pocas mutaciones puntuales recurrentes. No es sorprendente que algunos de los SNVs y SVs comunes encontrados en el tejido tumoral del OS no hayan sido identificados en este pequeño subconjunto de líneas celulares, probablemente debido a la evolución de las líneas celulares a lo largo del tiempo de cultivo.

Quizás lo más notable es que la conservación de las mutaciones en vías con relevancia funcional redundante subraya la probable importancia biológica de estas aberraciones en el OS. Este estudio destaca características importantes de cada una de estas líneas celulares, creando una hoja de ruta para los investigadores que persiguen la investigación de la medicina de precisión basada en hipótesis.

Por último, hemos detallado el uso de herramientas específicas y scripts modificados en este manuscrito para facilitar la implementación de esta línea de producción en otros conjuntos de datos WES/WGS caninos en los que no se dispone de muestras de referencia de la línea germinal. Además, como los pequeños cambios en la versión y los parámetros de ejecución de las herramientas computacionales pueden alterar notablemente los resultados, hemos puesto a disposición nuestras metodologías para facilitar el uso futuro de este enfoque en otros conjuntos de datos de secuenciación canina.

Conclusiones.

Las líneas celulares de osteosarcoma caninos son ampliamente representativas del paisaje genómico de los tejidos primarios de osteosarcoma caninos. La evaluación del panorama genómico, incluida la variación estructural, es importante para identificar con precisión la desregulación de las vías en los cánceres complejos cuando se utilizan líneas celulares en la investigación.

Cita: Megquier K, Turner-Maier J, Morrill K, Li X, Johnson J, Karlsson EK, et al. (2022) El paisaje genómico de las líneas celulares de osteosarcoma canino revela una complejidad estructural conservada y alteraciones de las vías. PLoS ONE 17(9): e0274383. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0274383

Editor: Douglas H. Thamm, Universidad Estatal de Colorado, ESTADOS UNIDOS

Recibido: 6 de junio de 2022; Aceptado: 25 de agosto de 2022; Publicado: 13 de septiembre de 2022

Por: Erik Farina (Etólogo Canino)

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