Un nuevo estudio del Cáncer de Hueso de los Perros.

 

Un nuevo estudio del Cáncer de Hueso de los Perros.

El paisaje genómico de las líneas celulares de osteosarcoma canino revela una complejidad estructural conservada y alteraciones de las vías.

Introducción.

Las líneas celulares establecidas se utilizan comúnmente en la investigación preclínica del cáncer para ayudar a diseccionar muchas facetas de la biología del tumor, incluyendo la sensibilidad a las nuevas terapias y el papel de las aberraciones moleculares y genéticas en la progresión de la enfermedad.

La última década ha sido testigo de un crecimiento y una utilización sin precedentes de los datos genómicos tumorales para guiar los enfoques terapéuticos, de diagnóstico y de pronóstico. Por lo tanto, la incorporación continua y precisa de datos in vitro en la investigación del cáncer requiere una comprensión completa del panorama genómico de estas herramientas.

Esto es especialmente relevante en la evaluación preclínica de terapias dirigidas, que dependen del conocimiento del espectro de alteraciones genéticas en las células cancerosas. Por ello, la secuenciación del genoma completo y del exoma de las líneas celulares (WGS y WES, respectivamente) se evalúa cada vez más al mismo tiempo que las muestras de tumores primarios.

Aunque se ha realizado una amplia documentación de las líneas celulares tumorales humanas y murinas, las líneas celulares tumorales caninas han sido objeto de un análisis genómico relativamente limitado. Dado que los perros con cáncer espontáneo se utilizan cada vez más para evaluar nuevas terapias en el entorno preclínico, es importante que las herramientas de acompañamiento utilizadas para los estudios in vitro se definan a fondo, en particular con respecto al paisaje genómico.

Por ejemplo, en los estudios preclínicos se emplean diversas líneas celulares de osteosarcoma (OS) canino; sin embargo, se han caracterizado principalmente utilizando métodos que definen un espectro relativamente estrecho de alteraciones moleculares y de vías.

Se ha evaluado un número limitado de líneas de osteosarcoma mediante RNA-seq y WES, demostrando firmas transcripcionales conservadas y mutaciones puntuales en TP53 con tumores secuenciados.

Nosotros y otros hemos caracterizado recientemente el osteosarcoma primario canino utilizando WGS, WES y secuenciación de ARN, demostrando una significativa complejidad estructural, incluyendo aberraciones en SETD2, DMD, DLG2 y MYC, entre otras.

Varias de ellas no se observaron en el examen previo de las líneas celulares de osteosarcoma canino, en gran parte debido a que una característica definitoria del OS canino es la presencia de grandes cambios estructurales que son más difíciles de detectar mediante WES. Por lo tanto, realizamos WGS en ocho líneas celulares de osteosarcoma canino para caracterizar el paisaje del genoma del tumor y evaluar las similitudes y diferencias entre estas líneas celulares y los tumores primarios de OS canino que se producen naturalmente.

Materiales y métodos.

Adquisición de líneas celulares y extracción de ADN

Las líneas celulares OSCA2 y OSCA8 (por ejemplo, OSA2 y OSA8) fueron un generoso regalo del Dr. Jamie Modiano (Universidad de Minnesota). Las líneas celulares Abrams y Gracie fueron proporcionadas por el Dr. Douglas Thamm (Universidad Estatal de Colorado).

El ADN genómico extraído de las líneas celulares HMPOS, McKinley (por ejemplo, MacKinley), Moresco (por ejemplo, Marisco) y OS2.4 fue proporcionado por el Dr. Douglas Thamm (Universidad Estatal de Colorado). Las cuatro líneas celulares restantes (OSCA2, OSCA8, Abrams, Gracie) fueron confirmadas como negativas al micoplasma mediante PCR antes del aislamiento del ADN.

El ADN se aisló utilizando el DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen Inc., Hilden, Alemania). Se llevó a cabo una validación adicional de la línea celular mediante el perfil de repeticiones cortas en tándem (STR) en el ADNg extraído utilizado para la WGS con loci disponibles comercialmente (kit de genotipado canino Stockmarks, Applied Biosystems) según las recomendaciones del fabricante y se comparó con los loci disponibles publicados para cada línea celular cuando estaban disponibles.

Construcción de bibliotecas y secuenciación.

La WGS fue realizada por la Plataforma Genómica del Instituto Broad en una plataforma Illumina con seguimiento de la muestra con LIMS automatizado como se describió previamente. Brevemente, 100 ng de ADN genómico fueron sometidos a un cizallamiento utilizando un sonicador ultrafocalizado Covaris, seguido de una limpieza con perlas SPRI.

Se utilizó el KAPA Hyper Prep Kit con Library Amplification Primer Mix (KAPA Biosystems; #KK8504) con adaptadores palindrómicos en horquilla que contenían una secuencia de índice única de 8 bases (Roche). Tras la normalización de las bibliotecas a 2,2 nM, se completó la amplificación de grupos y la secuenciación en un HiSeqX, utilizando los kits de secuenciación por síntesis para generar lecturas de 151 pb de extremo emparejado. Las muestras se secuenciaron a una profundidad objetivo de 30x.

Preprocesamiento de los datos de secuenciación.

Las muestras alcanzaron una profundidad de secuenciación media de 53,7x (rango 38,5x - 80,9x, Tabla S1). Los datos de secuenciación de la línea celular se procesaron mediante el flujo de trabajo ilustrado en la Fig. 1. Brevemente, los archivos fastq se alinearon con el genoma de referencia canino (CanFam3.1) utilizando BWA y posteriormente se sometieron a un control de calidad siguiendo las mejores prácticas de GATK.

Para todas las herramientas de GATK, se utilizó la versión 4.1.3.0, a menos que se indique lo contrario. Las lecturas duplicadas se identificaron utilizando Picard Tools MarkDuplicates (http://broadinstitute.github.io/picard). La recalibración de la puntuación de calidad de las bases (BQSR) se realizó utilizando un archivo VCF que contenía variantes de la línea germinal identificadas en 676 perros y otros cánidos.

Determinación de mutaciones somáticas simples.

Las mutaciones somáticas simples (variantes de un solo nucleótido (SNV) y pequeñas inserciones/deleciones (indels)) se detectaron utilizando un enfoque de llamada de consenso que combina Mutect2 y Platypus, los cuales permiten la llamada de variantes sin una muestra normal emparejada.

Mutect2 se ejecutó utilizando los scripts WDL de GATK Showcase disponibles en la plataforma de computación en la nube Terra. En primer lugar, se generó un panel de variantes normales utilizando datos WGS de la línea germinal de 23 perros de un conjunto de datos previamente publicado.

El VCF de las variantes de la línea germinal llamadas en 676 perros y otros cánidos se utilizó como referencia de la línea germinal, y un subconjunto de estas variantes se utilizó en el paso CalculateContamination.

Mutect2 se ejecutó con los argumentos adicionales "-downsampling-stride 20-max-reads-per-alignment-start 6-max-suspicious-reads-per-alignment-start 6". FilterMutectCalls se ejecutó con la opción "-run_orientation_bias_mixture_model_filter" ajustada a "True" y la opción "-min-median-read-position" ajustada a 10 pb.

Los cromosomas no anclados y mitocondriales se excluyeron de la llamada de variantes. Las variantes también se llamaron en las líneas celulares y en 23 BAMs WGS normales publicados utilizando Platypus (v. 0.8.1), con la bandera "-minReads" establecida en 3.

Empleamos un proceso de filtrado de varios pasos para identificar las llamadas de variantes de alta confianza y eliminar las variantes putativas de la línea germinal en la medida de lo posible. Como nuestro VCF de referencia de la línea germinal se había actualizado para eliminar dos individuos y todas las variantes no admitidas por los 674 individuos restantes, actualizamos el indicador de filtro en las llamadas de Mutect2 para reflejar estos cambios.

Paso 1: utilizando Bcftools (v. 1.12) se reajustó el indicador de filtro a "PASS" para cualquier variante en la salida de Mutect2 que se superpusiera a la posición de una variante eliminada de la referencia de la línea germinal y en la que el campo de filtro se estableciera como "línea germinal" solamente.

Paso 2: se utilizó el mismo enfoque para restablecer la bandera "alleleBias" en la salida de Platypus, ya que esto podría eliminar las variantes somáticas de baja fracción alélica. Paso 3: se creó un panel de normales para los datos de Platypus fusionando las llamadas de variantes de las mismas muestras de la línea germinal utilizadas en el panel Mutect2.

A continuación, se utilizó el comando isec de Bcftools para eliminar las llamadas de variantes en los datos de la línea celular de Platypus que se solapaban con la posición de una variante llamada en el panel de normales.

Paso 4: se eliminaron los sitios con una bandera de filtro no pasante utilizando Bcftools view. Paso 5: Bcftools isec se utilizó para mantener sólo las variantes llamadas tanto en Mutect2 como en Platypus para cada línea celular. Paso 6: Bcftools isec se utilizó para eliminar las variantes putativas de la línea germinal vistas en el VCF de referencia de la línea germinal, en el conjunto de SNPs de la línea germinal de Broad, o en el conjunto de SNPs de la línea germinal de Axelsson.

Paso 7: se utilizó la vista de Bcftools para eliminar las llamadas de variantes con una fracción alélica (AF) < 0,05, profundidad de lectura (DP) < 10, o menos de 3 lecturas que apoyaran el alelo alternativo. Paso 8: los sitios somáticos putativos restantes fueron regenotipados en 23 muestras normales de la línea germinal utilizando la herramienta Graphtyper, y las variantes encontradas en las muestras de la línea germinal fueron filtradas utilizando Bcftools.

Las variantes pasantes se anotaron utilizando SnpEff v5.0e. El paquete KaryoploteR, usando R (R3.5.0) fue implementado para identificar áreas de kataegis [35]. Se crearon gráficos de mutaciones con la herramienta lollipops. Los genes con mutaciones recurrentes fueron priorizados por su probable relevancia en el OS canino como se describió previamente.

Llamada de razas.

Los archivos BAM preprocesados se genotiparon en ubicaciones de variantes putativas de la línea germinal utilizando GATK HaplotypeCaller (versión 4.1.0.0) con el modo de ajuste de genotipado GENOTYPE_GIVEN_ALLELES. Se utilizó una versión anterior de nuestra referencia de línea germinal como lista de sitios a genotipar.

Esta referencia de línea germinal contenía 435 muestras (287 perros de raza pura, 6 perros con ascendencia desconocida, 100 perros indígenas o de pueblo de todo el mundo, 36 lobos y otros 6 cánidos salvajes). Para determinar la raza de cada línea celular, se creó el pipeline de llamada de raza seleccionando datos de genotipos disponibles públicamente (N = 1.212) [25, 26, 37] de 101 razas modernas con al menos 12 perros de raza pura por raza.

Se calculó la estadística F de Wright mediante el método de Hudson para cada raza utilizando 2.468.442 polimorfismos de nucleótido único bialélicos con <10% de genotipos perdidos. Se seleccionaron los SNPs con FST>0,15 en todas las comparaciones y se realizó una poda basada en LD en ventanas de 50kb (r2>0,5) para extraer 688.060 marcadores para la inferencia de la ascendencia global. Se fusionaron los genotipos de estos SNPs de las líneas celulares con los genotipos de las muestras de referencia, y luego se realizó la inferencia de ascendencia global utilizando ADMIXTURE [38] en modo supervisado (semilla aleatoria: 43).

Llamada a la firma mutacional.

Se utilizó la herramienta SigProfilerMatrixGenerator [39] para generar una matriz de contextos mutacionales variantes. A continuación, se utilizó la herramienta SigFit (v2.2) para identificar las firmas de sustitución de base única (SBS) de COSMIC v3 [41] presentes en los datos de la línea celular.

La matriz de oportunidades mutacionales para el genoma CanFam3.1 fue amablemente proporcionada por Adrián Báez-Ortega, de la Universidad de Cambridge, uno de los autores de SigFit. El ajuste se realizó con 10.000 iteraciones y 5.000 iteraciones de calentamiento, utilizando el modelo multinomial. Se seleccionaron las firmas que eran suficientemente mayores que cero (lo que significa que el extremo inferior del intervalo Bayesiano HPD era > 0,025 en cualquier muestra) y se volvió a realizar el ajuste utilizando sólo esas firmas.

Llamada de variantes estructurales.

Las aberraciones somáticas del número de copias (SCNAs) se detectaron utilizando el pipeline GATK somatic CNV, a través del espacio de trabajo Terra showcase WDLs. Se creó un panel autosómico de normales utilizando las 23 muestras de la línea germinal, y se crearon paneles sólo de hombres y sólo de mujeres para el cromosoma X. La opción "do_explicit_gc_correction" se estableció en "True" para la creación del panel. Como el sexo del donante no estaba anotado para muchas de las líneas celulares, determinamos el sexo basándonos en la relación de la profundidad media de las lecturas en los autosomas y en el cromosoma X (determinada por la herramienta GATK DepthOfCoverage).

Los ratios de cobertura X/autosoma entre 0,3 y 0,7 se consideraron masculinos, y los ratios entre 0,8 y 1,2 se consideraron femeninos. Se realizó la llamada de CNV, con los parámetros de suavización "kernel_variance_allele_fraction" y "kernel_variance_copy_ratio" establecidos en 0,8, y "num_changepoints_penalty_factor" establecido en 5. Los gráficos de CNV se rehicieron utilizando un archivo DICT ordenado para trazar los cromosomas en orden numérico y excluir los cromosomas no anclados y mitocondriales.

Las pérdidas de número de copias con un cambio de pliegue log2 de ≥ 0,4 (ganancia de una copia) o ≤ -0,9 (pérdida de dos copias) se consideraron en nuestro análisis. Se utilizó un script personalizado de Python para anotar el solapamiento de los segmentos de número de copias con los genes utilizando la anotación de genes caninos de Ensembl (Release 99).

Las variantes estructurales (SV) se llamaron utilizando la versión 1.6.0 de Manta. Las líneas celulares y las 23 muestras normales de la línea germinal se ejecutaron por separado utilizando la configuración de sólo tumor o línea germinal, según el caso. Los VCFs de salida se procesaron utilizando el script "convertInversion.py" proporcionado por Manta para convertir las inversiones al antiguo formato INV, en lugar del formato actual de final de ruptura (BND). Para mitigar la incidencia de falsos positivos cuando se analizan muestras derivadas de tumores no coincidentes, se realizaron múltiples pasos de filtrado.

Paso 1: se creó un panel de normales fusionando las llamadas SV de los 23 VCFs de la línea germinal con cada uno de los VCFs de la línea celular utilizando la herramienta Jasmine [45], usando los ajustes "-nonlinear_dist max_dist = 1000", "-output_genotypes", y "-keep_var_ids". Se utilizó un script personalizado de Python para añadir genotipos al campo "GT" de manera que los VCFs pudieran ser analizados por Bcftools.

Todos los genotipos se fijaron en 0/1. Para cada línea celular-panel de normales fusionado VCF, se extrajeron los IDs de variantes presentes en la línea celular pero en ninguna de las normales. Paso 3: utilizando Bcftools, se eliminaron los IDs de variantes presentes en las normales, así como las variantes en las que el campo de filtro no era "PASS", que estaban marcadas como "IMPRECISO", o en las que ni el soporte de lecturas emparejadas (PR) ni el de lecturas divididas (SR) era mayor o igual a 15. Se utilizó la herramienta "vcfbedsetfilter" de Jvarkit para marcar las variantes que se solapaban con las regiones centroméricas putativas (ventanas de 5000 pb que contienen ≥80% de repeticiones centroméricas, de https://github.com/Chao912/Mischka/CanFam3.1.centromere.bed).

Paso 4: las variantes restantes no filtradas se volvieron a genotipar en las muestras normales utilizando la herramienta Graphtyper, y cualquier variante con soporte en una muestra normal se eliminó utilizando Bcftools. Paso 5: los extremos de ruptura de translocación en los que se había filtrado un extremo en un paso anterior se eliminaron utilizando Bcftools.

  

Comparación con la literatura.

Identificamos cinco conjuntos de datos WES o WGS publicados de tejido canino OS (Sakthikumar, et al. [16], Gardner, et al. [18], Das, et al. [17], Chu, et al. [19]) o líneas celulares (Das, et al. [1]). Las llamadas de variantes se obtuvieron en formato VCF o tabular a partir de los datos suplementarios y se estandarizaron en formato VCF. Para minimizar la variabilidad debida a la anotación de genes y a la estrategia de secuenciación, limitamos nuestra comparación a las regiones codificantes (específicamente, las regiones CDS en la anotación canina Ensembl Release 99) utilizando la vista Bcftools, y reanotamos los VCF de cada estudio utilizando Snpeff.

Se excluyeron las variantes anotadas como de bajo impacto. Las variantes estructurales, incluidas las variantes de número de copias de Gardner, et al. y Chu, et al., se convirtieron de formato tabular a archivos bed. Las regiones superpuestas dentro de cada muestra se fusionaron utilizando Bedtools merge. Los segmentos de número de copias que se encontraron significativamente alterados de forma recurrente en Sakthikumar, et al. también se convirtieron a formato de cama para su comparación, pero no se pudo realizar un recuento de VNC a nivel de muestra.

Los genes solapados por una variante estructural se anotaron utilizando Bedtools annotate para contar el número de solapamientos de las regiones CDS en la anotación canina de Ensembl dentro de cada conjunto de datos. Debido a la falta de información sobre las coordenadas de los extremos de los puntos de rotura para las translocaciones en la literatura, no se pudo realizar una estandarización, y las translocaciones se compararon contando el número de veces que un gen determinado fue anotado como afectado en cada conjunto de datos.

Resultados.

Validación de la línea celular.

Se extrajo el ADN aislado de cada línea celular y se confirmó que era de origen canino y la línea celular de origen declarada mediante interrogación multiplataforma. El perfil de STR y la PCR específica de la especie confirmaron que el ADN secuenciado era canino, y los loci de STR eran coherentes con los comunicados anteriormente.

Además, la llamada de raza y la cobertura de secuenciación sobre el cromosoma X confirmaron el origen de la raza y el sexo de las líneas celulares tumorales cuando se disponía de datos previamente publicados, e identificaron esta información para varias líneas en las que dicha información no estaba disponible públicamente.

Es importante destacar que los perros de la aldea no tienen ascendencia de raza, lo que hace que el algoritmo de llamada de razas llame a muchas razas diferentes, cada una de las cuales se reporta como contribuyente de una pequeña fracción. Esto es especialmente importante para los conjuntos de datos de WGS en los que no se dispone de una muestra de referencia de ADN de la línea germinal, ya que las bases de datos existentes de variación de la línea germinal pueden no capturar con precisión el espectro de variantes normales de la línea germinal en estos perros, lo que da lugar a la aparición falsa de una mayor carga de mutaciones.

Por último, las llamadas de variantes de un solo nucleótido (SNV) entre las diferentes líneas celulares no fueron concordantes, lo que concuerda con la correcta identificación de las líneas celulares y la ausencia de contaminación cruzada entre ellas.

Variantes de un solo nucleótido en las líneas celulares del OS canino.

Las mutaciones sin sentido fueron las SNV codificantes más comunes identificadas en las líneas celulares del OS canino, con una fracción menor de mutaciones de cambio de marco y otros eventos disruptivos. No es sorprendente que se identificara una alta incidencia de variantes no codificantes, incluyendo variantes en la región de empalme y variantes en la región no traducida 3' y 5'.

Es probable que la falta de una referencia de línea germinal emparejada condujera a una mayor incidencia de llamadas falsas positivas en el genoma no codificante. Sin embargo, se reconoce cada vez más que las variantes en las regiones reguladoras contribuyen a la tumorigénesis. Aunque se desconoce la importancia de estas variantes, se justifica una mayor interrogación de las mutaciones no codificantes que pueden afectar a los genes impulsores del cáncer para empezar a atribuir importancia funcional a los elementos no codificantes en el SO.

A pesar de un filtrado exhaustivo, la carga mutacional en cada línea celular, calculada en 5,8 mut/Mb (rango 2,1-14,7, Tabla S5) fue mayor que la reportada previamente en tejidos primarios de OS caninos y humanos [18, 49]. Es probable que esto sea el resultado de un pasaje a largo plazo de las líneas celulares y de la falta de una muestra de referencia de línea germinal del individuo en el que se originó el tumor.

En las líneas celulares Gracie y OSCA-8 se identificaron regiones de hipermutación focal sugestivas de kaetegis. La línea celular HMPOS, que se originó en un perro de pueblo cuya ascendencia no está bien representada en nuestro panel de referencia, tuvo la mayor carga mutacional aparente.

En consonancia con las muestras de tejido primario del OS, las SNV codificantes más comunes fueron las mutaciones en TP53 (7/8; 88%), predominantemente compuestas por mutaciones de sentido erróneo con una menor incidencia de mutaciones de cambio de marco. El único otro gen con SNV codificantes identificado en al menos tres líneas celulares fue DST, un gen que codifica la distonina, una proteína de enlace del citoesqueleto.

Todos los demás SNV codificantes recurrentes eran privados de una o dos líneas celulares. Sin embargo, el espectro de SNVs observado era en gran medida representativo del identificado en las muestras de tejido primario del OS canino, con mutaciones implicadas en la reparación del ADN y el ciclo celular, genes reguladores epigenéticos y de la cromatina, y las vías de señalización PI3K y MAPK.

Comparamos nuestras llamadas de mutaciones somáticas simples con las reportadas previamente en muestras de tejido de OS canino WES/WGS. De los 3.836 genes con SNVs/INDELs notificados en al menos un tumor de OS en estos estudios, 272 (7%) también estaban mutados en al menos una línea celular. TP53 fue el más comúnmente mutado, tanto en la literatura (64%) como en nuestros datos (88%).

De los genes notificados en al menos el 5% de las muestras de OS, FSIP2 (13% de líneas celulares, 11% notificado en la literatura), TTN (3% de líneas celulares, 9% notificado en la literatura), ENSCAFG00000000632 (13% de líneas celulares, 7% notificado en la literatura), RYR2 (13% de líneas celulares, 5% reportado en la literatura), UNC80 (13% líneas celulares, 5% reportado en la literatura), LRP1B (13% líneas celulares, 5% reportado en la literatura), y XIRP2 (13% líneas celulares, 5% reportado en la literatura) fueron mutados en al menos una línea celular.

  

Varios genes comúnmente reportados como mutados en muestras de OS no tenían mutaciones somáticas simples en ninguna de las líneas celulares, más notablemente SETD2 (19% reportado en la literatura), así como NEB (12% reportado en la literatura).

También examinamos la concordancia de nuestras llamadas SNV e INDEL WGS con las reportadas previamente a partir de la secuenciación WES de las mismas líneas celulares. En general, una media del 49% de las variantes codificantes reportadas en WES de estas líneas celulares fueron confirmadas por WGS (rango 35% (McKinley)- 73% (OS2.4)).

Se evaluó el contexto trinucleotídico de los SNV, identificando la exposición a las firmas de sustitución de base única (SBS) de COSMIC v3 en las llamadas de SNV de las líneas celulares.

Las firmas SBS1 (la "firma del envejecimiento", asociada a la desaminación espontánea de la 5-metil-citosina), SBS5 (una firma "tipo reloj" de etiología desconocida), SBS8 (etiología desconocida), SBS9 (posiblemente debida a la hipermutación somática a través de la polimerasa eta en las células linfoides), SBS17a (etiología desconocida), SBS17b (asociada en algunos casos humanos a la quimioterapia con fluorouracilo y al daño por especies reactivas del oxígeno), SBS19 (etiología desconocida), SBS22 (exposición al ácido aristolóquico), SBS30 (deficiencia en la reparación de la escisión de bases, asociada a la pérdida de la función de NTHL1), SBS32 (asociada al tratamiento con azotiaprina), SBS35 (asociada a la quimioterapia con platino), SBS36 (deficiencia en la reparación de la escisión de bases, asociada a la pérdida de la función de MUTYH), SBS37 (etiología desconocida), SBS39 (etiología desconocida) y SBS40 (etiología desconocida, asociada al envejecimiento en algunos cánceres humanos) se identificaron en proporciones variables en las líneas celulares [41]. Las mayores contribuciones fueron las firmas SBS1, SBS40 y SBS5.

Las firmas SBS1, SBS5, SBS8, SBS17a, SBS17b, SBS30, y SBS40 han sido previamente reportadas en muestras de OS humano, mientras que las firmas SBS1, SBS8, SBS9, y SBS17b han sido reportadas en OS canino.

  

Variantes estructurales en las líneas celulares del OS canino.

Se identificaron VS, incluyendo deleciones, inserciones, inversiones, translocaciones y duplicaciones. La incidencia media de VS en este panel de líneas celulares fue de 1139 VS por línea celular, lo cual es notablemente más alto que lo reportado en los tejidos del OS y probablemente sea el resultado de la falta de una muestra de línea germinal compatible disponible. Los SV más comunes fueron deleciones y translocaciones cromosómicas complejas.

En consonancia con las VS reportadas en los tejidos primarios del OS, estaban presentes variantes estructurales sin número de copias que involucraban a DMD (4/8 (50%) líneas celulares), DLG2 (5/8 (62,5%) en este estudio), CDKN2A (6/8 (75%)), MAGI2 (7/8 (88%)), y MLLT3 (6/8 (75%)). En particular, se identificaron múltiples variantes que afectan a los genes epigenéticos y reguladores de la cromatina en todas las líneas celulares, lo que apoya las afirmaciones anteriores que implican alteraciones del paisaje epigenético en la biología del OS.

En 2/8 (25%) de las líneas celulares de este estudio se encontraron deleciones a gran escala que abarcan SETD2, mientras que otra línea celular tenía una duplicación que implicaba a SETD2. Por último, se identificaron SV recurrentes adicionales en NF1 (8/8 (100%)), NEDD4L, una ubiquitina ligasa E3 responsable de la homeostasis de PTEN (7/8 (88%)), así como en los genes de la desmetilasa de histonas KDM4A y KDM4C (alteración en uno de los dos presentes en todas las líneas celulares de este estudio), y KDM5A y KDM5C, (alteración en uno de los dos presentes en todas las líneas celulares de este estudio).

Variantes estructurales en las líneas celulares del OS canino.

Se identificaron VS, incluyendo deleciones, inserciones, inversiones, translocaciones y duplicaciones. La incidencia media de VS en este panel de líneas celulares fue de 1139 VS por línea celular, lo cual es notablemente más alto que lo reportado en los tejidos del OS y probablemente sea el resultado de la falta de una muestra de línea germinal compatible disponible. Los SV más comunes fueron deleciones y translocaciones cromosómicas complejas.

En consonancia con las VS reportadas en los tejidos primarios del OS, estaban presentes variantes estructurales sin número de copias que involucraban a DMD (4/8 (50%) líneas celulares), DLG2 (5/8 (62,5%) en este estudio), CDKN2A (6/8 (75%)), MAGI2 (7/8 (88%)), y MLLT3 (6/8 (75%)). En particular, se identificaron múltiples variantes que afectan a los genes epigenéticos y reguladores de la cromatina en todas las líneas celulares, lo que apoya las afirmaciones anteriores que implican alteraciones del paisaje epigenético en la biología del OS.

En 2/8 (25%) de las líneas celulares de este estudio se encontraron deleciones a gran escala que abarcan SETD2, mientras que otra línea celular tenía una duplicación que implicaba a SETD2. Por último, se identificaron SV recurrentes adicionales en NF1 (8/8 (100%)), NEDD4L, una ubiquitina ligasa E3 responsable de la homeostasis de PTEN (7/8 (88%)), así como en los genes de la desmetilasa de histonas KDM4A y KDM4C (alteración en uno de los dos presentes en todas las líneas celulares de este estudio), y KDM5A y KDM5C, (alteración en uno de los dos presentes en todas las líneas celulares de este estudio).

Del mismo modo, se identificaron diversas mutaciones y aberraciones del número de copias en los genes de la vía PI3K y MAPK, y todas las líneas celulares presentaban al menos una alteración en MAP2K1, MAP2K2, MAP2K4 o MAP2K5. En consonancia con la noción de que el OS es genómicamente heterogéneo, pocas aberraciones en genes individuales fueron recurrentes. Además, se identificaron pérdidas de número de copias, deleciones, inversiones y translocaciones en PTEN (5/8 (62,5%) líneas celulares) y NEDD4L (7/8 (88%)), lo que sugiere que la desregulación de la vía PI3K mediada por PTEN debe considerarse en el contexto de mutaciones concurrentes en NEDD4L, una ubiquitina ligasa E3 que regula negativamente a PTEN.

Discusión.

Las líneas celulares establecidas se han utilizado durante mucho tiempo para estudiar la biología del tumor y la respuesta a las terapias dirigidas. Más recientemente, la evaluación de un solo gen y la WES se han utilizado para trazar el paisaje mutacional de las líneas celulares de cáncer canino, proporcionando un recurso crucial para los estudios prospectivos.

Los datos de la WGS aquí reportados identificaron muchas mutaciones somáticas simples previamente publicadas en conjuntos de datos de WES. Sin embargo, el uso de la WGS permitió interrogar a las CNVs y a las SVs, permitiendo una comprensión más completa del espectro de la desregulación de las vías en las células del OS canino. Esto es particularmente importante en los cánceres genómicamente complejos, como el OS, donde las SNVs de punto caliente son menos comunes.

Mientras que muchas de las mutaciones somáticas simples conocidas asociadas al OS canino se conservaron entre las líneas celulares evaluadas en este estudio, algunas mutaciones típicamente encontradas en los tejidos primarios del OS estaban ausentes. Una característica sorprendente fue la ausencia de mutaciones somáticas simples en SETD2 en las líneas celulares utilizadas en este estudio. Sin embargo, SETD2 se eliminó en dos líneas celulares, y había mutaciones en las desmetilasas de lisina H3K36, lo que sugiere que los mecanismos que impulsan la desregulación de H3K36 son una característica fundamental del OS canino.

La concordancia con las llamadas SNV/INDEL entre las mismas líneas celulares incluidas en nuestro análisis y el análisis WES de Das, et al. fue moderada, y las discrepancias observadas se debieron probablemente a varios factores. Se sabe que los diferentes métodos de secuenciación y llamada de variantes tienen una baja concordancia. Además, el uso de distintos umbrales de filtrado de variantes y de diferentes bases de datos de la línea germinal probablemente dio lugar a la eliminación de conjuntos divergentes de mutaciones. Por otra parte, las presiones selectivas del cultivo in vitro y la inestabilidad genómica actual suelen impulsar el desarrollo de una importante heterogeneidad genética entre diferentes cepas de la misma línea celular

Se identificó una mayor carga mutacional en las líneas celulares del OS en comparación con los tejidos del OS. En parte, esto representa probablemente un error de tipo I debido a la falta de una muestra de línea germinal compatible. Esto es especialmente relevante en la línea celular HMPOS, que se determinó que procedía de un perro de pueblo basándose en nuestro algoritmo de llamada de raza y tiene una variedad de polimorfismos de un solo nucleótido no catalogados en nuestros archivos de recursos de variantes de línea germinal. Como la mayoría de las variantes genéticas son raras, y los perros de pueblo son más diversos genómicamente que los perros de raza pura, la falta de un normal emparejado probablemente dio lugar al mayor número de llamadas de variantes somáticas falsas positivas en la línea HMPOS.

La incorporación de un control de línea germinal emparejado se utiliza habitualmente para minimizar las llamadas de mutaciones falsas positivas en los conjuntos de datos de WES y WGS. Desarrollamos una línea de filtrado estricta tanto para las variantes somáticas simples como para las estructurales con el fin de reducir la aparición de falsos positivos debidos a la falta de una muestra de línea germinal emparejada. Los fundamentos de esta canalización son métodos establecidos en el campo; sin embargo, se aplicó de forma más estricta en este contexto. Por ejemplo, eliminamos cualquier variante que se superpusiera a una variante en nuestro recurso de línea germinal en lugar de exigir que se viera en dos o más individuos.

No exigimos que los alelos alternativos coincidieran, ya que encontramos casos en los que los alelos fueron anotados de forma diferente por distintas herramientas, a pesar de parecer la misma variante. Además, añadimos un paso de regenotipado con la herramienta GraphTyper, que identificó cualquier soporte para variantes somáticas putativas en nuestro panel de normales. Este paso fue especialmente útil para filtrar los INDELs en los que diferentes herramientas podrían situar las posiciones de inicio y final en lugares alternativos.

Creemos que este paso puede explicar algunas de las discrepancias en las llamadas somáticas simples reportadas en nuestro estudio y el estudio de Das, et al. para las mismas líneas celulares. No obstante, debido a las dificultades mencionadas y a la falta de validación ortogonal de nuestras llamadas de variantes, recomendamos que los investigadores validen las variantes de interés con una fracción alélica baja antes de realizar análisis posteriores adicionales.

En general, nuestros datos demuestran que el caótico paisaje genómico de las líneas celulares del OS canino coincide con el observado en el tejido tumoral primario del OS canino, definido por una alta complejidad estructural y pocas mutaciones puntuales recurrentes. No es sorprendente que algunos de los SNVs y SVs comunes encontrados en el tejido tumoral del OS no hayan sido identificados en este pequeño subconjunto de líneas celulares, probablemente debido a la evolución de las líneas celulares a lo largo del tiempo de cultivo.

Quizás lo más notable es que la conservación de las mutaciones en vías con relevancia funcional redundante subraya la probable importancia biológica de estas aberraciones en el OS. Este estudio destaca características importantes de cada una de estas líneas celulares, creando una hoja de ruta para los investigadores que persiguen la investigación de la medicina de precisión basada en hipótesis.

Por último, hemos detallado el uso de herramientas específicas y scripts modificados en este manuscrito para facilitar la implementación de esta línea de producción en otros conjuntos de datos WES/WGS caninos en los que no se dispone de muestras de referencia de la línea germinal. Además, como los pequeños cambios en la versión y los parámetros de ejecución de las herramientas computacionales pueden alterar notablemente los resultados, hemos puesto a disposición nuestras metodologías para facilitar el uso futuro de este enfoque en otros conjuntos de datos de secuenciación canina.

Conclusiones.

Las líneas celulares de osteosarcoma caninos son ampliamente representativas del paisaje genómico de los tejidos primarios de osteosarcoma caninos. La evaluación del panorama genómico, incluida la variación estructural, es importante para identificar con precisión la desregulación de las vías en los cánceres complejos cuando se utilizan líneas celulares en la investigación.

Cita: Megquier K, Turner-Maier J, Morrill K, Li X, Johnson J, Karlsson EK, et al. (2022) El paisaje genómico de las líneas celulares de osteosarcoma canino revela una complejidad estructural conservada y alteraciones de las vías. PLoS ONE 17(9): e0274383. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0274383

Editor: Douglas H. Thamm, Universidad Estatal de Colorado, ESTADOS UNIDOS

Recibido: 6 de junio de 2022; Aceptado: 25 de agosto de 2022; Publicado: 13 de septiembre de 2022

Por: Erik Farina (Etólogo Canino)

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Cómo difieren las proteínas entre las especies

 

Cómo difieren las proteínas entre las especies.

Para comprender mejor lo que impulsa la diversidad biológica en la Tierra, los científicos se han fijado históricamente en las diferencias genéticas entre especies. Pero esto sólo ofrece una parte del panorama. Los rasgos de una especie concreta no son sólo el resultado de sus genes, sino también de las proteínas que esos genes codifican. Por tanto, comprender las diferencias entre los proteomas de las especies, o todas las proteínas que pueden expresarse, es tan importante como entender las diferencias entre los genomas.

En un nuevo estudio, los investigadores de la Universidad de Yale han comparado los proteomas de las células de la piel de 11 mamíferos, lo que, dicen, ayudará a los científicos a comprender los factores moleculares de la biodiversidad y cómo han evolucionado a lo largo del tiempo.

Descubrieron que, si bien muchas proteínas varían de forma similar tanto entre especies como dentro de ellas, algunas son más variables entre especies, lo que proporciona pistas sobre qué proteínas podrían ser más importantes en la evolución de los mamíferos. El trabajo también podría ayudar a los investigadores a entender por qué algunas especies son más resistentes al cáncer.

"Para entender la diversidad biológica, además de saber cómo el ADN es diferente en las distintas especies, también hay que saber cómo las especies se comportan, se desarrollan y tienen un aspecto diferente", dijo Günter Wagner, profesor emérito de Ecología y Biología Evolutiva Alison Richard.

Y se cree que estos atributos, el aspecto, el comportamiento y el desarrollo de una especie, están más relacionados con los niveles de proteínas que con el ADN, explicó Yansheng Liu, profesor adjunto de farmacología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Yale.

Sin embargo, comparar las cantidades de proteínas entre especies ha sido difícil, ya que no ha existido la tecnología necesaria para realizar análisis a gran escala. Pero Liu ha aplicado un método llamado espectrometría de masas de adquisición independiente de datos que ahora permite a los investigadores realizar este tipo de trabajo.

"Se trata de un avance conceptual y técnico que nos permite trabajar a este nivel superior y funcionalmente más relevante", dijo Wagner.

Liu es miembro del Instituto de Biología del Cáncer de Yale y Wagner es miembro del Instituto de Biología de Sistemas, ambos situados en el Campus Oeste de Yale. Fue allí, durante un simposio de biología de sistemas del cáncer al que ambos asistieron, donde comenzó su colaboración.

Para el estudio, los investigadores cuantificaron todas las proteínas expresadas en las células de la piel de 11 especies de mamíferos: conejos, ratas, monos, humanos, ovejas, vacas, cerdos, perros, gatos, caballos y zarigüeyas.

El análisis, según descubrieron, proporcionaba información que no podía obtenerse mediante otras técnicas. Por ejemplo, si bien las investigaciones anteriores han analizado las diferencias en el ARNm, el material genético utilizado para crear proteínas, descubrieron que la medición de las proteínas proporcionaba información adicional que no podía captarse analizando únicamente el ARNm, ya que éste es sólo una medida indirecta de la abundancia de proteínas.

Una cadena de ARNm lleva el código para crear una proteína. Y mientras que las proteínas individuales pueden tener una función concreta, las proteínas también pueden interactuar entre sí y actuar como grupos, explicó Liu. El mero hecho de observar el ARNm no proporciona esa información.

"Descubrimos que, sobre todo en el caso de ciertas clases de proteínas, la relación de éstas con el ARNm es muy baja", dijo Liu. "Eso significa que el perfil de ARNm por sí solo sería engañoso".

A continuación, el equipo examinó la variación de las proteínas tanto entre especies como entre individuos de la misma especie, y descubrió que, para la mayoría de las proteínas, los niveles que eran más variables entre individuos también lo eran entre especies. Pero había algunas proteínas que no se ajustaban a esa tendencia.

 

Por ejemplo, las proteínas relacionadas con la división celular y el metabolismo del ARN eran más variables entre especies que entre individuos de una misma especie (los humanos, en este caso). Esto sugiere que esas funciones desempeñan un papel especialmente importante en la evolución de los mamíferos, dijeron los investigadores.

"Las diferencias entre especies y entre individuos son muy interesantes desde el punto de vista evolutivo", dijo Wagner. "Comparar las dos nos da una idea de cuánta variación se tolera dentro de una especie y podemos utilizar esa información para predecir la capacidad de evolución".

Por último, los investigadores compararon los sistemas de eliminación de proteínas entre especies. Hay dos sistemas principales responsables de la eliminación de proteínas en las células, y descubrieron que uno era similar en todas las especies, mientras que el otro presentaba bastantes variaciones entre los distintos mamíferos.

Este recambio de proteínas determina la rapidez con la que una célula puede cambiar su estado, añadió Wagner. "Si llega una nueva señal, la célula tiene que desechar las proteínas que eran necesarias para su estado anterior y crear otras nuevas", dijo.

Y la rapidez con la que una célula cambia de estado podría ser relevante para el cáncer.

"Las células sanas pueden verse influidas por las células cancerosas cercanas", afirma Wagner. "Será importante entender si las tasas de recambio de proteínas están relacionadas con la reactividad de las células a las influencias de las células tumorales. Quizá las especies más resistentes al cáncer, como los animales con pezuñas, como las vacas y los cerdos, tengan células menos capaces de cambiar de estado y menos susceptibles a las señales de las células cancerosas."

Y comprender la vulnerabilidad al cáncer es sólo una de las posibles aplicaciones de este trabajo, dicen los investigadores. Por ejemplo, pueden empezar a correlacionar las diferencias de las proteínas con cualquier otro rasgo que difiera entre especies, dice Liu.

Las proteínas están sujetas a modificaciones químicas, que se producen cuando otras moléculas se unen a una proteína y la activan o desactivan. Y estas modificaciones contribuyen a los rasgos que difieren entre las especies y dentro de ellas, ya que desempeñan un papel importante que influye en la función de las proteínas.

Los investigadores evaluaron un tipo de modificación en este estudio, la fosforilación, y descubrieron que las variaciones en los niveles de fosforilación no estaban relacionadas, en su mayor parte, con las variaciones en la abundancia de proteínas, lo que proporciona otra capa de comprensión sobre lo que impulsa la biodiversidad. Los investigadores seguirán evaluando otras modificaciones en futuros trabajos.

"Proporcionará una imagen más completa", dijo Liu, añadiendo que las variabilidades biológicas entre especies e individuos son las que dan forma a la diversidad biológica en la Tierra. "Medir las diferencias tanto de las proteínas como de las proteínas modificadas entre las especies hará avanzar nuestra comprensión de la biodiversidad a nivel molecular".

Fuente de la historia: Materiales proporcionados por la Universidad de Yale. Original escrito por Mallory Locklear.

Universidad de Yale. "Las raíces de la biodiversidad: Cómo difieren las proteínas entre las especies". ScienceDaily. ScienceDaily, 9 de septiembre de 2022. <www.sciencedaily.com/releases/2022/09/220909160312.htm>.

Por: Erik Farina (Etólogo Canino)

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Análisis longitudinal del microbioma rectal en perros con diabetes mellitus tras el inicio del tratamiento con insulina

 

Análisis longitudinal del microbioma rectal en perros con diabetes mellitus tras el inicio del tratamiento con insulina.

Se han realizado numerosos estudios en humanos y roedores que corroboran el papel del microbioma gastrointestinal en la patogénesis y la progresión de la diabetes mellitus de tipo 1 y 2. La diabetes mellitus es una endocrinopatía común en los perros; sin embargo, se sabe poco sobre la composición del microbioma intestinal durante el desarrollo y el tratamiento de la diabetes en esta especie.

El objetivo de este estudio piloto era caracterizar el microbioma gastrointestinal de los perros con diabetes mellitus en el momento del diagnóstico y durante las primeras 12 semanas de tratamiento con insulina e identificar las asociaciones con el control glucémico. Se recogieron hisopos rectales y suero para medir la fructosamina de 6 perros diabéticos recién diagnosticados a intervalos de 2 semanas durante 12 semanas.

Las muestras rectales se secuenciaron utilizando cebadores 16S, ITS y arqueas. Se evaluaron las medidas de diversidad alfa y beta para ver si había cambios a lo largo del tiempo; se identificaron las asociaciones entre las abundancias relativas de las variantes de secuencia absolutas (ASV) y el tiempo y la concentración de fructosamina mediante un modelo de efectos lineales multivariante específico para el microbioma.

No se observaron cambios estadísticamente significativos a lo largo del tiempo en la diversidad alfa y las muestras se agruparon significativamente por perro y no por tiempo en el análisis de la diversidad beta.

Sin embargo, múltiples ASV se asociaron negativa (Clostridium sensu stricto 1, Romboutsia, Collinsella) y positivamente (Streptococcus, Bacteroides, Ruminococcus gauveauii, Peptoclostridium) con el tiempo y dos ASV se asociaron positivamente con la fructosamina (Enterococcus, Escherichia-Shigella). Estos cambios en la composición microbiana gastrointestinal justifican una mayor investigación sobre cómo pueden relacionarse con la progresión o el control de la diabetes mellitus en los perros.

Introduccion.

En la salud, el microbioma intestinal desempeña un papel clave en una serie de procesos fisiológicos, como la absorción de nutrientes, el metabolismo energético, la regulación inmunitaria y el mantenimiento de la barrera gastrointestinal [1-4]. Por el contrario, las alteraciones del microbioma, denominadas disbiosis, se asocian a una serie de enfermedades, incluida la diabetes mellitus (DM) [5, 6]. La evidencia actual sugiere que la disbiosis contribuye al desarrollo de la DM e interfiere con su manejo exitoso a través de una variedad de mecanismos.

La inflamación se propone como un vínculo fundamental entre el microbioma intestinal y la DM. En estos pacientes, la disbiosis se caracteriza generalmente por un aumento de patógenos oportunistas que generan inflamación de bajo nivel y estimulan la producción de mediadores inflamatorios. Al mismo tiempo, hay una disminución de las poblaciones bacterianas que producen ácidos grasos de cadena corta (AGCC), como el butirato, que son esenciales para la salud del epitelio intestinal y la inmunotolerancia de la flora intestinal normal.

Por lo tanto, la disminución de la producción de butirato conduce a un deterioro de la función de la barrera de la mucosa y perpetúa aún más los efectos sistémicos de la inflamación intestinal. El microbioma intestinal tiene efectos adicionales sobre el control glucémico del huésped. Los AGCS, los indoles y otros mediadores estimulan la liberación de hormonas incretinas, que son un factor determinante de la liberación de insulina postprandial.

La modulación de la reserva de ácidos biliares por parte de los microbios intestinales también influye en la secreción de incretina y altera el manejo hepático de la glucosa y el glucógeno. Además, la microbiota entérica influye en la función del tejido adiposo, que desempeña un papel importante en la regulación metabólica. Así pues, parece haber una relación compleja entre el microbioma intestinal y el estado glucémico.

En la DM tipo 1, se sospecha que la disbiosis y la inflamación intestinal estimulan el sistema inmunitario, lo que puede contribuir o desencadenar la destrucción autoinmune del páncreas endocrino. Esta teoría está apoyada por los cambios progresivos en los marcadores de disbiosis en niños con DM tipo 1 a lo largo del tiempo, desde antes de la seroconversión hasta el desarrollo de autoanticuerpos a la hiperglucemia manifiesta.

  

Además, se ha demostrado que la manipulación temprana del microbioma intestinal retrasa la aparición de la DM de tipo 1 en modelos de ratón. En la DM de tipo 2, se cree que los mediadores inflamatorios de la inflamación intestinal de bajo nivel inducen la resistencia a la insulina, contribuyendo tanto al desarrollo como a la perpetuación de la hiperglucemia. Varios estudios han documentado la presencia de disbiosis en los diabéticos de tipo 2, incluyendo asociaciones entre las abundancias relativas de las especies y los marcadores de la regulación diabética, como la glucemia en ayunas y la hemoglobina a1c.

A pesar de la creciente evidencia en medicina humana, el papel del microbioma en la DM canina es relativamente desconocido. La DM es una endocrinopatía común en los perros con una prevalencia reportada de aproximadamente 0,34-1,2% . Aunque no se clasifica típicamente como tipo 1 o tipo 2, los perros tienen características de ambos con una deficiencia absoluta de insulina debido a la destrucción de las células de los islotes pancreáticos y factores concurrentes que promueven la resistencia a la insulina y complican la regulación.

Dadas las similitudes entre la DM humana y la canina, es posible que la DM canina también esté asociada a la disbiosis. Hasta la fecha, sólo un estudio ha evaluado esta hipótesis. Este estudio transversal descubrió que los perros diabéticos no presentaban una diferencia estadística en la diversidad alfa en comparación con un grupo de perros de control, aunque sí tenían una mayor abundancia relativa de Enterobacteriaceae en comparación con los controles sanos.

Sin embargo, este estudio sólo analizó un único punto temporal e incluyó perros en varias fases de tratamiento y control diabético; por lo tanto, no se pueden hacer inferencias sobre las alteraciones del microbioma en el momento del diagnóstico o las transiciones durante el tratamiento. Así pues, el impacto del tratamiento de la DM en el microbioma gastrointestinal de los diabéticos caninos sigue siendo desconocido.

El estudio descrito aquí fue un estudio piloto longitudinal y prospectivo que evaluó el microbioma rectal de perros diabéticos recién diagnosticados durante las primeras 12 semanas de tratamiento. El objetivo principal de este estudio era caracterizar el microbioma gastrointestinal de los perros con DM en el momento del diagnóstico y durante el tratamiento.

Nuestra hipótesis era que inicialmente habría cambios en la diversidad y composición del microbioma rectal de los perros diabéticos desde el momento del diagnóstico hasta las primeras 12 semanas de tratamiento. En concreto, la hipótesis era que la diversidad alfa aumentaría con el tiempo de tratamiento y que la abundancia relativa de patógenos oportunistas, como las Enterobacteriaceae, disminuiría, mientras que los organismos productores de butirato, como los Firmicutes, aumentarían a medida que avanzara el tratamiento.

Un objetivo secundario era evaluar la abundancia de los taxones microbianos en relación con la fructosamina del paciente, como marcador cuantitativo del control diabético. Nuestra hipótesis era que habría correlaciones significativas entre la fructosamina y la abundancia relativa de uno o más taxones en este estudio.

Material y métodos.

Los Perros.

Se reclutaron perros diabéticos recién diagnosticados a través de clínicas veterinarias de atención primaria asociadas. Los perros se presentaron por los signos clínicos relacionados con su enfermedad. En el momento del diagnóstico, a todos los perros se les realizó un recuento sanguíneo completo, un perfil bioquímico sérico, un análisis de orina, un cultivo de orina, concentraciones séricas de tiroxina total, fructosamina, cobalamina y folato, inmunoreactividad similar a la tripsina (TLI) e inmunoreactividad de la lipasa pancreática (PLI) para descartar enfermedades concurrentes.

Se excluyeron los perros si los diagnósticos indicaban una enfermedad concurrente, como una infección del tracto urinario, una insuficiencia pancreática exocrina o una neoplasia. No se excluyeron los perros con aumento de TLI, PLI o enzimas hepáticas. Además, se excluyeron los perros que recibieron antibióticos en las 4 semanas anteriores a la inscripción o durante el periodo del estudio y los perros que tuvieron un cambio de dieta en las 4 semanas anteriores a la inscripción o durante el periodo del estudio.

Se confirmó que todos los perros comían un alimento comercial para perros, nutricionalmente equilibrado, y que seguían esa misma dieta durante al menos un mes antes del inicio del estudio. Los perros se mantuvieron con su dieta anterior a la investigación durante todo el estudio. Si los perros admitidos requerían antibióticos, desarrollaban una enfermedad o sufrían un cambio en la dieta, se excluían de seguir participando, pero las muestras recogidas antes de la desviación del protocolo se incluían en el análisis. El manejo de la diabetes, incluida la elección y la dosis de insulina, quedó a discreción del veterinario de atención primaria.

Los perros fueron evaluados cada 2 semanas durante las primeras 12 semanas de tratamiento con insulina, momento en el que se registró el peso, se recogió suero para la medición de la fructosamina, se obtuvieron hisopos rectales y se completaron cuestionarios por parte del propietario y del veterinario de atención primaria (Archivo S1). Los cuestionarios incluían información sobre la raza, el peso, las puntuaciones de la condición corporal y muscular, el sexo, la edad, la dieta, los antecedentes de medicación, el apetito, la ingesta de agua y la micción, el nivel de actividad, la dosis y el tipo de insulina, y la evaluación subjetiva del control. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Illinois (Protocolo nº 18043).

Recogida y manipulación de muestras de hisopos rectales.

Los veterinarios de atención primaria recogieron hisopos rectales, suero y orina. Se introdujeron hisopos estériles (Copan FLOQSwab; Copan Inc., Murrieta, CA) en el recto y se barrieron con un movimiento circular. Los hisopos se colocaron en un recipiente seco. Las muestras se enviaron el mismo día o se almacenaron durante la noche a 4°C. Las muestras se enviaron durante la noche en hielo. Una vez recibidas, el suero y la orina se procesaron el mismo día y los hisopos rectales se almacenaron a -80°C hasta que se realizó la extracción de ADN.

Extracción de ADN

El ADN se extrajo de los hisopos rectales utilizando el QIAamp PowerFecal Pro Kit DNA (QIAGEN, Hilden, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante, con la excepción de que los hisopos rectales se utilizaron en el paso inicial de batido de cuentas en lugar de las heces. Para evaluar el grado de contaminación microbiana en los hisopos y reactivos, también procesamos un hisopo estéril (sin usar) y 200 μL de agua estéril sin nucleótidos en lugar de los hisopos rectales en el protocolo de extracción de ADN. La concentración de ADN en los extractos se determinó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop 1000 (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) con comprobación de la calidad mediante electroforesis en gel de agarosa.

Preparación de la biblioteca y secuenciación.

Las muestras de hisopo rectal se enviaron para la cuantificación relativa de eubacterias, arqueas y hongos en el Centro de Biotecnología de la Universidad de Illinois. Además de las muestras de hisopo rectal, se enviaron los dos controles negativos de la extracción de ADN y un control negativo adicional consistente en agua estéril sin nucleótidos.

En primer lugar, se preparó la biblioteca de secuenciación mediante el sistema Fluidigm Access Array (Fluidigm Corporation, South San Francisco, CA) utilizando los siguientes cebadores V3_F357_N (5-CCTACGGNGGCWGCAG-3) y V4_R805 (5-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3) para la región V3-V4 del ARNr 16S eubacteriano; Arch349F (5-GYGCASCAGKCGMGAAW-3) y Arch806R (5-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3) para el ARNr 16S arqueano; e ITS3 (5-GCATCGAATGAAGAACGCAGC-3) e ITS4 (5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3) para la región del espaciador transcrito interno 2 de las especies fúngicas. La secuenciación se llevó a cabo en la plataforma Illumina MiSeq (Illumina, Inc., San Diego, CA) utilizando lecturas de extremos emparejados de 250 pb.

Procesamiento bioinformático de las secuencias.

El procesamiento de las secuencias en bruto se realizó con el software Quantitative Insights into Microbial Ecology (versión 2). Las secuencias se desmultiplexaron primero para eliminar las secuencias índice específicas de la muestra. Se utilizó el plugin Dada2 para generar una tabla de características de variantes de secuencia absoluta (ASV). La taxonomía de las ASV se asignó utilizando la base de datos de referencia SILVA (versión 138.1).

Las secuencias demultiplexadas y alineadas se procesaron posteriormente utilizando el paquete R phyloseq. Las ASVs con un filo no asignado fueron eliminadas y las ASVs restantes fueron filtradas para excluir los taxones de baja abundancia utilizando un umbral de prevalencia del 50%. Finalmente, la matriz de recuento filtrada se aglomeró en el nivel taxonómico de género.

Análisis estadístico.

Los datos demográficos y clínicos se presentan de forma descriptiva. Todos los datos de secuenciación de amplicones se analizaron en el lenguaje R para programación estadística (versión 4.0.3; Bunny-Wunnies Freak Out) [20]. El índice de diversidad de Shannon (SDI), una estimación de la diversidad alfa, se calculó para cada muestra utilizando la matriz de recuento de ASV en bruto [21]. Se utilizaron modelos lineales generalizados de efectos mixtos para evaluar el efecto sobre el SDI del tiempo de recogida de muestras tras la administración de insulina.

Se utilizaron métodos no supervisados para detectar los cambios en la estructura de la comunidad de la microbiota asociados a diferentes puntos temporales tras el inicio del tratamiento con insulina. La diversidad beta se estimó mediante la matriz de disimilitud de Bray-Curtis, generada a partir de la matriz de recuento ASV filtrada y aglomerada, y se visualizó con el escalamiento multidimensional no métrico (NMDS).

Se utilizó el análisis multivariante de la varianza (PERMANOVA) para detectar diferencias estadísticas en la estructura de la comunidad microbiana entre los perros individuales y los puntos de recogida de muestras. El PERMANOVA se implementó en la matriz de disimilitud de Bray Curtis con 1.000 permutaciones utilizando la función adonis del paquete vegano.

Se utilizó la Asociación Multivariable del Microbioma con Modelos Lineales (MaAsLin2) para detectar ASVs diferencialmente abundantes entre los puntos temporales de recogida de muestras y las asociaciones entre ASVs y las concentraciones de fructosamina en suero. La matriz de recuento de ASVs fue normalizada por el método de escala de suma total (TSS) y transformada logarítmicamente antes del análisis.

Para comprender el impacto de las pruebas múltiples, se calculó una estimación de la tasa de falsos descubrimientos (FDR) utilizando el método de Benjamini-Hochburg. Los resultados se consideraron estadísticamente significativos cuando el valor p bruto era < 0,05, independientemente de la FDR.

Resultados.

Población.

Se incluyeron seis perros en el estudio, con un perro perdido en el seguimiento después de la sexta semana. Cuatro eran machos y 2 hembras, todos castrados. La edad media era de 7,3 años (rango 7,7-11) y el peso medio era de 16 kg (rango, 4,2-42,6). Las razas de perro representadas eran un chihuahua, un boyero australiano, un labrador retriever, un grifón de Bruselas, una mezcla de yorkshire terrier y un pomerania (tabla 1).

Todos los perros se presentaron a su veterinario de atención primaria con la queja principal de poliuria y polidipsia y se observó además que un perro había perdido peso y había desarrollado ceguera. Según los registros de atención primaria, todos los perros habían perdido peso desde el examen previo al diagnóstico de diabetes mellitus, pero cinco de los seis perros tenían sobrepeso. Cinco de los seis perros fueron tratados con insulina NPH y un perro fue tratado con insulina porcina en suspensión de zinc (Vetsulin, Merck Animal Health, De Soto, KS).

Parámetros clínicos de control de la diabetes mellitus.

El control de la diabetes se evaluó objetivamente mediante el seguimiento de la fructosamina sérica y el peso, y subjetivamente mediante la evaluación de la ingesta de agua, la diuresis y el apetito. Hubo una tendencia general a la baja de la fructosamina con el tiempo y el peso parecía estable durante el tratamiento.

La mayoría de los perros también tenían una ingesta de agua y una micción estables o normalizadas, según la evaluación de los propietarios, y todos tenían un mejor control subjetivo, según la evaluación del veterinario principal, desde el momento del diagnóstico en la semana 0 hasta la finalización del estudio en la semana 12.

Estadísticas de la secuenciación del 16S-ARNr.

Se generó un total de 3.581.921 secuencias a partir de 2036 ASV únicas. Excluyendo los controles negativos, la profundidad media de secuenciación fue de 96.462 lecturas por muestra (9.192-146.597). Para comprender el grado de contaminación ambiental y de reactivos, secuenciamos tres muestras de control negativo.

Generamos un total de 9.340 secuencias de 7 ASV únicas en las tres muestras de control negativo, casi todas ellas del filo Proteobacteria, incluyendo tres del género Escherichia-Shigella y una del género Azomonas. Las secuencias de Escherichia-Shigella representaban más del 89% de las ASV en las tres muestras de control negativo.

Tras eliminar las muestras de control negativo, filtrar las secuencias de baja abundancia y aglomerar los recuentos de ASV en el género, quedaron 2.649.900 secuencias de 29 ASV únicas, con una profundidad media de 73.224 (6962-110.625) secuencias por muestra.

Diversidad alfa y beta.

Se calculó el índice de diversidad de Shannon (SDI) para cada perro en cada punto temporal y se comparó a lo largo del tiempo y entre perros. No hubo diferencias significativas en el SDI a lo largo del tiempo (p = 0,32; Fig. 3). El escalado multidimensional no métrico (NMDS) de la matriz de disimilitud de Bray Curtis (Fig 4) y el PERMANOVA revelaron que el origen de la muestra con respecto a un perro individual era una fuente significativa de variación en las comunidades microbianas (R2 = 0,46; P = 0,01).

Hubo una separación de las muestras de dos perros (pacientes ID 8 y 11) recogidas antes de la administración de insulina (semana 0) recogidas después del inicio de la terapia de insulina, pero el punto de tiempo de recogida no fue una fuente de variación estadísticamente significativa en la estructura de la comunidad según el PERMANOVA (R2 = 0,02; P = 0,39).

Arqueas y hongos.

La mayoría de los amplicones de los cebadores de arqueas mapearon especies eubacterianas y sólo se detectaron 3 ASV de arqueas verdaderas, todas ellas aisladas de un solo perro. Del mismo modo, los cebadores ITS detectaron sólo 3 taxones de hongos, todos ellos pertenecientes al género Malassezia. Los cebadores ITS también produjeron un amplicón de un nematodo, Passalarus ambiguus.

  

Discusión.

En medicina humana, hay un creciente cuerpo de evidencia que sugiere que el microbioma intestinal contribuye al desarrollo y perpetuación de la DM. La disbiosis se reconoce sistemáticamente en múltiples estudios de diabéticos humanos y se asocia tanto con la autoinmunidad de las células de los islotes como con la resistencia a la insulina [5, 6]. Además, se ha demostrado que las alteraciones terapéuticas del microbioma mediante el uso de probióticos, el trasplante de microbiota fecal y las modificaciones dietéticas mejoran el metabolismo de la glucosa.

Por lo tanto, entender y manipular el microbioma en la DM tiene la posibilidad de mejorar los resultados clínicos de los pacientes diabéticos. En cambio, se sabe poco sobre el estado del microbioma intestinal en la DM canina. Terapias similares dirigidas al microbioma también podrían mejorar el control glucémico en perros, pero primero se requiere una mejor caracterización de la disbiosis asociada a la DM en estos pacientes.

En este estudio piloto, identificamos varios ASVs en el microbioma intestinal de perros diabéticos recién diagnosticados que cambiaron en abundancia relativa con el tiempo durante las primeras 12 semanas de terapia con insulina. Además, identificamos dos ASVs cuya abundancia relativa se correlacionó positivamente con la concentración de fructosamina en suero, un marcador comúnmente utilizado para el control glucémico en medicina veterinaria.

En el presente estudio, varios taxones bacterianos aumentaron su abundancia relativa durante las primeras 12 semanas de tratamiento con insulina. De ellos, el Bacteroides fue de especial interés. Se ha informado anteriormente de que Bacteroides spp. tiene efectos positivos sobre la tolerancia a la glucosa y la sensibilidad a la insulina. Este hallazgo es consistente en los estudios realizados en diabéticos humanos. En los estudios de casos y controles, la abundancia relativa de Bacteroides spp. suele disminuir en los diabéticos en comparación con los pacientes no diabéticos y, en los estudios de intervención, la abundancia relativa aumenta con las terapias para diabéticos.

Las Bacteroides spp. son algunas de las bacterias productoras de butirato mejor descritas y promueven la salud de los colonocitos y la integridad de las uniones estrechas. Así, se cree que la mejora de la sensibilidad a la insulina se produce a través de la reducción de la permeabilidad intestinal, la producción de LPS y la inflamación sistémica. Es posible que un mecanismo similar esté presente en los diabéticos caninos, lo que podría haber contribuido a la mejora general del estado clínico de los animales en el presente estudio.

También identificamos dos ASVs que disminuyeron en abundancia relativa durante el periodo de estudio, Roumboutsia y Clostridium sensu strictu 1; estos disminuyeron desde la línea de base en varios puntos de tiempo. En humanos con DM tipo 2, el aumento de la abundancia relativa de Roumboutsia se ha asociado con una mala tolerancia a la glucosa y una reducción de los niveles de insulina en ayunas. Por lo tanto, una disminución en la abundancia relativa durante las primeras 12 semanas de tratamiento de la DM puede representar un mejor control glucémico en nuestros perros de estudio.

 

Por el contrario, la abundancia relativa de Clostridium sensu strictu 1 está generalmente disminuida en pacientes humanos con DM tipo 2 y gestacional. Teniendo en cuenta este hallazgo, se podría esperar que la abundancia relativa aumentara con una mejor regulación diabética, en lugar de disminuir, como se observó en el presente estudio.

Sin embargo, la asociación entre Clostridium sensu strictu 1 y el estado metabólico se ha documentado principalmente en estudios transversales que comparan a los diabéticos con los controles sanos, y no en estudios longitudinales, por lo que la comparación directa entre éstos y el presente estudio puede no ser aplicable. Alternativamente, esta disparidad podría representar diferencias relacionadas con la especie en el microbioma intestinal y/o diferencias en la patogénesis de la DM entre humanos y perros.

Nuestro análisis también evaluó las correlaciones entre la abundancia relativa de ASV y las concentraciones de fructosamina en suero. La fructosamina es una medida indirecta de la glicosilación de las proteínas séricas, que aumenta durante la hiperglucemia crónica. Se utiliza habitualmente en combinación con los signos clínicos como medida del control diabético en pacientes caninos. Dos taxones bacterianos, Enterococcus y Escherichia-Shigella, se asociaron positivamente con la fructosamina sérica en este estudio.

Este último taxón, Escherichia-Shigella, es particularmente interesante ya que se ha documentado que la abundancia relativa de la familia Enterobacteriaceae, de la que son miembros Escherichia-Shigella, aumenta en los perros diabéticos en comparación con los controles sanos. Es importante señalar que Escherichia-Shigella es un contaminante común en los reactivos de laboratorio y las secuencias representaron >89% de los ASV en los 3 controles negativos de nuestro estudio.

Por lo tanto, la abundancia de Escherichia-Shigella en las muestras de los sujetos podría haber sido falsamente elevada. A pesar de esto, esperamos que la contaminación de los reactivos de laboratorio sea consistente en todas las muestras, por lo que la asociación positiva con la concentración de fructosamina en suero probablemente represente verdaderos procesos biológicos en lugar de contaminación.

Aunque identificamos cambios en las abundancias relativas de varias ASV, no identificamos ningún cambio significativo en la diversidad alfa o beta. Las medidas de diversidad alfa (por ejemplo, el índice de diversidad de Shannon) y beta (por ejemplo, el índice de disimilitud de Bray Curtis) detectan grandes cambios en la diversidad dentro de las poblaciones microbianas y entre ellas, respectivamente, pero son insensibles a los cambios en los taxones bacterianos individuales.

Así, es posible que se produzcan cambios significativos e importantes en las abundancias relativas de bacterias clave sin que ello afecte a las medidas de diversidad. De hecho, este fenómeno se produce habitualmente en los estudios que investigan el microbioma intestinal de los pacientes diabéticos humanos. La falta de cambios en las medidas de diversidad en nuestro estudio podría deberse a varios factores diferentes. En primer lugar, nuestro estudio se diseñó como un estudio piloto y, por tanto, su número de participantes fue limitado.

Es posible que se hubieran observado cambios más drásticos en la diversidad con más perros o con un curso de tiempo más largo. Además, es posible que la DM de algunos perros no estuviera adecuadamente controlada en la semana 12 de tratamiento, lo que podría haber dificultado la detección de cambios en la diversidad asociados al control glucémico. El tipo de insulina también varió entre los perros, lo que podría haber ocultado los cambios en la diversidad a lo largo del tiempo.

  

Es interesante observar que sólo un perro fue tratado con suspensión de insulina zinc porcina, mientras que los demás recibieron NPH. Este perro tuvo un descenso más precipitado de la fructosamina y, subjetivamente, el veterinario consideró que el perro estaba bien controlado. Por último, es posible que las alteraciones del microbioma intestinal durante la terapia diabética inicial en perros se deban más a los cambios en la abundancia relativa de unos pocos taxones clave que a las medidas generales de diversidad.

La mayor parte de las investigaciones sobre el microbioma se centran en la composición bacteriana, pero los organismos fúngicos y arqueos no suelen ser explorados a pesar de que se estima que comprenden el 1% y el 0,01-0,3% de las células microbianas en las muestras fecales, respectivamente. Dado que todos los ASV fúngicos generados en este estudio eran del género Malassezia, sospechamos que los organismos identificados procedían de la piel y no del recto debido al método de recogida.

No existe un método de recogida universal que proporcione una muestra representativa de todo el tracto gastrointestinal, pero la mayoría de los investigadores utilizan muestras fecales, ya que son fáciles de recoger y no son invasivas. Nuestros resultados podrían haber sido diferentes si se hubieran utilizado muestras fecales evacuadas, pero seleccionamos hisopos rectales para mantener la consistencia entre múltiples centros y asegurar que se recogieran muestras de cada visita. El hallazgo de P. ambiguus es inesperado, ya que se trata de un oxiuro específico de los conejos que no se conoce que infecte a los perros, y especulamos que representa la ingestión de ADN de oxiuros que pasaba por el tracto gastrointestinal del perro.

Una limitación importante del análisis de abundancia diferencial en este estudio es el alto FDR entre los resultados significativos. Muchos estudios similares utilizan el FDR como umbral de significación estadística, aceptando resultados con valores p ajustados por el FDR que van de <0,05 a <0,25. Los autores reconocen que éste sería un enfoque más sólido para asignar la significación estadística, en comparación con los valores p no ajustados (brutos).

Dado que se trata de un estudio piloto, hemos tratado de encontrar un equilibrio entre evitar los falsos descubrimientos y no descubrir diferencias reales que puedan servir de base para futuras investigaciones específicas. Por lo tanto, hemos proporcionado las estimaciones de la FDR para todos los resultados significativos para que el lector pueda comprender la probabilidad de que un resultado determinado sea un falso descubrimiento. Hacemos hincapié en que nuestros resultados deberían confirmarse en futuros estudios que utilicen muestras de mayor tamaño y enfoques específicos para cuantificar las comunidades microbianas.

Este estudio piloto se diseñó para caracterizar los cambios en el microbioma gastrointestinal de los perros con DM durante las primeras 12 semanas de tratamiento, no para asignar la causalidad entre la composición microbiana intestinal y la salud del huésped. Sin embargo, estos resultados demuestran cambios en el microbioma intestinal de los perros con diabetes durante el tratamiento inicial con insulina. Estas tendencias justifican la investigación futura en esta área, incluyendo estudios prospectivos sobre los cambios a largo plazo en el microbioma y cómo la modificación del microbioma con terapias como los probióticos o el trasplante de microbios fecales puede afectar al tratamiento de la diabetes en los perros.

Además, es esencial investigar la interacción entre la insulina y la terapia dietética en el microbioma de los perros diabéticos. En el presente estudio, mantuvimos a los perros en su dieta previa al diagnóstico para aislar mejor el efecto del tratamiento con insulina. Sin embargo, muchos veterinarios recomiendan un cambio de dieta como parte del tratamiento de la diabetes. El impacto de la combinación de cambio de dieta y terapia de insulina en el microbioma gastrointestinal podría tener implicaciones significativas para futuras terapias de perros diabéticos difíciles de regular.

Conclusiones.

Este estudio evaluó las alteraciones del microbioma intestinal en perros diabéticos recién diagnosticados con el objetivo de identificar los cambios correlacionados con el tiempo y la fructosamina. Aunque no se observaron cambios estadísticamente significativos en la diversidad, varias especies bacterianas tuvieron cambios en la abundancia relativa asociados con el tiempo y las concentraciones de fructosamina en suero. Los cambios identificados aquí justifican una mayor investigación para mejorar nuestra comprensión del papel del microbioma gastrointestinal en la diabetes mellitus canina, lo que podría conducir a futuras estrategias de tratamiento específicas.

Agradecimientos

Los autores agradecen a los doctores Jason Verbeck, Auldon Francis y Patty McElroy su ayuda en el reclutamiento de pacientes y la recogida de muestras. Los autores también agradecen al Dr. Christopher Fields su ayuda en el análisis de los datos.

Por: Nicole L. Laia, Patrick C. Barko, Drew R. Sullivan, Maureen A. McMichael, David A. Williams, Jennifer M. Reinhart.

(2022) Análisis longitudinal del microbioma rectal en perros con diabetes mellitus tras el inicio del tratamiento con insulina. PLoS ONE 17(9): e0273792. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0273792 

Editor: Jasbir Singh Bedi, Universidad de Ciencias Veterinarias y Animales Guru Angad Dev, INDIA

Copyright: © 2022 Laia et al

Por: Erik Farina (Etólogo Canino)

PSICOLMASCOT

Contacto: psicolmascot@gmail.com

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Cómo empezar bien en el Adiestramiento Canino

 

Cómo empezar bien en el Adiestramiento Canino

Los Primeros Tanteos

Incluso si ya se ha tenido perro, conocer a uno nuevo no deja de ser toda una aventura. No hay dos perros iguales, y hasta dentro de una misma raza cada individuo tiene su propia personalidad y forma de comportarse que a veces, difieren enormemente.

Lo normal es que humanos y perros necesiten semanas e incluso meses para conocerse bien mutuamente y que cada uno sepa cómo el otro va a reaccionar. En cualquier caso, planificar los sucesivos pasos de nuestra relación con el perro puede evitar muchos conflictos y malentendidos.

Indudablemente, cualquiera de los dos puede llevarse alguna que otra mala sorpresa con respecto al otro durante las primeras semanas, pero un poco de previsión le puede ahorrar muchas lágrimas y dolores de cabeza en el futuro.

Recibirlo Bien, Paciencia y Comprensión

Si su nuevo perro es un cachorro, probablemente acabará de separarse de su madre y hermanitos para venirse con usted, y es lógico que ahora se sienta muy solo. Todo lo que le rodea es diferente y extraño para él. Incluso aunque en casa haya otro perro, éste olerá diferente y se comportará de forma distinta a como lo hacían los perros con los que hasta ese momento ha convivido.

Si su nuevo perro es adulto, y ya está acostumbrado al entorno doméstico, los objetos que le rodean no le parecerán tan extraños como a un cachorro, pero usted sigue siendo un completo desconocido para el perro.

En este momento, la calma y la coherencia son vitales para el perro nuevo, independientemente de su edad. Es posible que usted sienta el impulso de hacer movimientos bruscos, gritar o incluso correr hacia el perro si lo sorprende haciendo algo que considera inaceptable, pero evite hacerlo, más bien deténgase, espere y medite.

Su perro va a necesitar algún tiempo para conocerle y para entender las reglas que rigen en su hogar. Incluso tardará en reconocer sus diferentes tonos de su voz. Si no quiere asustar al nuevo perro o cachorro, tenga mucha paciencia. Lo primero de todo es evitar que se sienta atemorizado o incómodo.

Lenguaje Corporal del Perro

Los perros no pueden expresar con palabras que se sienten inseguros, desamparados y solos, ni redactar un escrito de protesta contra los olores, imágenes o ruidos que les resultan desagradables o perturban en el hogar. Sólo pueden expresar sus sentimientos y temores por medio de gestos corporales y faciales y ciertos sonidos.

Un cachorro que se asusta al encontrarse de pronto con un perro grande tal vez adopte la postura utilizada para expresar sumisión; acercará su cuerpo al suelo lo más posible, son las orejas hacia atrás y la cola metida entre las patas. También es posible que se orine o defeque a causa del miedo. ¿No querrá ser saludado de esta forma por su nuevo compañero de casa, verdad?.

Un perro adulto, por su parte, reaccionará mal si se siente intimidado en un lugar desconocido para el perro: si le sujeta o agarra para obligarlo a salir o para impedirle hacer algo, usted creerá no estar haciéndole nada malo, pero el animal se sentirá castigado y maltratado hasta el punto de que podría incluso utilizar sus garras o fauces para defenderse de usted.

Normas de Convivencia

Aunque evitando asustar o intimidar al nuevo perro, usted tiene que establecer algunas normas elementales desde el primer instante de convivencia. Si deja claras las reglas desde el principio y es coherente con ellas, ayudará al perro a sentirse seguro. Los perros, como los niños, necesitan aprender dónde están los límites.

Algunos perros intentan poner a prueba al propietario y sortearlos, mientras que otros las aceptan tranquilamente. Sean cuales sean las normas o limitaciones que usted imponga, recuerde siempre esto: si quiere que su perro las acate, déjelas claras desde el primer instante o será tarde después.

Es mucho más fácil imponer unas normas desde el principio que corregir una conducta indeseable una vez adquirida la costumbre. Aunque le parezca un poco exagerado redactar las reglas por escrito, será lo más sensato si su familia es numerosa y todos los miembros van a relacionarse con el perro, ya que de ese modo todos se comprometerán a tratar al perro exactamente de la misma forma.

El perro jamás podrá saber qué está bien y que está mal si unos le riñen y otros le premian por hacer la misma cosa. Si se sube al sofá y se acurruca junto a alguien, tal vez haya quien lo premie con mimos y caricias y quien lo mande al suelo con gritos y empujones. No se puede esperar que ningún perro entienda que cada miembro de la familia impone distintas normas.

Las Normas de Convivencia Familiar

-Si el perro salta sobre usted, girase y dale la espalda para que no vea su cara e ignóralo. Prémialo cada vez que salude sin saltar sobre la gente, siempre con las cuatro patas en el suelo.

-Nunca le dé porciones de alimento mientras está sentado en la mesa, o estará enseñándole a mendigar comida.

-No deje cosas por medio. Los cachorros se siente irresistiblemente atraídos por la ropa sucia, los juguetes infantiles y el papel.

-Utilice juguetes apropiados para jugar con el perro, nunca zapatos o zapatillas.

-Adiestre a su perro sin prisa pero sin pausa, varias veces al día y todos los días de la semana.

-Enseñe al perro a sentarse antes de recibir el alimento, la sesión de cepillado o las caricias y antes de salir de casa o del coche.

-Todos los miembros de la familia deben participar en su educación, alimentación, cepillado, salidas a hacer ejercicio, etc., e imponer la misma disciplina.

-Los perros se sientan en el suelo: los asientos son sólo para los humanos.

-Decida dónde va a dormir el cachorro y manténgase firmes a ese respecto.

-Si empieza a mordisquear algo de muebles o zapatos, debes distraerlo con un juguete que pueda morder, especificando que puede morder y que no puede morder.

Para una consulta o información puede llamar al número de teléfono; 674 41 52 33

Por: Erik Farina (Etólogo Canino)

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